[发明专利]LOV蛋白突变体及其应用

说明书

本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及LOV蛋白突变体及其应用。本发明公开了一种生物相容性好，与细胞内黄素自动组装形成高效荧光探针的基因与蛋白的制备方法，以及能将细胞内黄素组装形成高效荧光探针的方法和应用。这一系列类型荧光蛋白质能应用于生物和医学分子监测领域的荧光探针，还可以以此为基础开发出性能更加高效的荧光探针或光敏剂，应用于生物、医学等领域。

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及LOV蛋白突变体及其应用。

背景技术

随着生物领域科学研究的拓展与深入，荧光探针的应用范围和应用领域也不再仅局限于最初被发现的生物领域，还主要应用于生物分子、蛋白质、细胞等生物定性和定量分析检测实验中。其中拓展不同波段范围的荧光探针，标记生物研究中常用的细胞器之类的研究也成为了热点。常用的用于分子检测和成像蛋白质的荧光分子探针通常由荧光发色团-配体结合物组成，使它们能够高选择性地靶向并因此标记目标蛋白。

目前最为人们熟知的荧光报告蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。GFP可以在不同生物体的广泛宿主范围内表达，并用作实时荧光探针，以监测活细胞中蛋白质的表达、定位、折叠和相互作用。然而，GFP家族蛋白需要分子氧来进行荧光成熟，这阻碍了它们在严格的厌氧微生物中的应用，导致其作为荧光报告分子的应用受到限制。

基于黄素单核苷酸的光受体蛋白(FbFP)，被成功地改编为有氧和厌氧生物系统中不依赖氧的荧光探针，同时也是光敏剂。LOV结构域属于FbFP，最近几年通过修饰LOV结构域发挥其作用并拓展其应用成为研究者们热衷的研究方向，它们不仅自发荧光可以被利用于细胞内目标物如细胞器等的精确定位示踪，还有可能变成对多种领域临床或生活应用有价值的基因编码光敏剂。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种LOV蛋白突变体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

为了克服现有技术中荧光报告蛋白应用灵敏度、应用范围等受自身或应用对象等条件限制的不足，本发明将水稻LOV基因突变进化到高效荧光蛋白，即LORO1.1-1.8。LORO1.1-1.8可以在模式生物中通过对细胞内在色素FMN自动组装，表达形成具有高荧光量子产率的高效荧光蛋白，进一步证明了LORO1.6和LORO1.8在哺乳动物细胞中可作为荧光探针。

通过对LOV结构域中关键位点进行点饱和突变，并结合其突变效应，进而对突变体进行光谱分析、荧光量子产率和摩尔消光系数等参数的分析，筛选到在大肠杆菌体内表达且荧光增强，活性更好的突变体，用于研究开发蓝紫光区域的荧光蛋白生物探针，拓宽FMN和LOV的应用范围，从而开发出稳定性高、亮度较强的新型细胞内在色素型荧光蛋白：LORO1.1-1.8。因为FMN是细胞内源色素，有利于与LORO1.1-1.8结合而作为荧光探针，同时它与LORO1.1-1.8结合，可以在体外或体内通过光诱导在细胞内或整个身体的特定位置产生活性氧，从而既可以作为荧光探针也可以作为基因编码的光敏剂。

本发明将提供一种生物相容性好，与细胞内在色素FMN自动组装形成的具有高色素结合能力、高荧光量子产率的荧光蛋白：LORO1.1-1.8。其中LORO1.6和LORO1.8可以作为在哺乳动物细胞中应用的荧光探针。

本发明是这样实现的，LOV蛋白突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.9中的任一种。

本发明还提供了如上述的LOV蛋白突变体在制备荧光探针中的应用。

进一步地，所述LOV蛋白突变体与FMN细胞色素结合而作为荧光探针。

进一步地，所述荧光探针应用于哺乳动物细胞。

进一步地，所述哺乳动物细胞包括HEK293T细胞。

本发明还提供了如上述的LOV蛋白突变体在制备基因编码的光敏剂中的应用。