[发明专利]一种假病毒的制备方法

说明书

本发明提供了一种假病毒的制备方法，对现有载体进行改造，改造载体中包括优化的大肠杆菌MS2噬菌体的衣壳蛋白基因的序列，所述的序列为SEQ IDNO.1‑6中的一种或多种，改造载体转化细菌并表达以获得具有更高包装效率的假病毒。本发明提供的假病毒长期保存稳定性有所增强，对假病毒进行冻干，可以在室温保存更长时间。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种假病毒的制备方法。

背景技术

装甲RNA(Armored RNA)技术是一种新的RNA质控品制备技术，该技术解决了传统RNA质控品稳定性差，存在生物传染隐患，且达不到监测核酸提取及反转录过程的目的等问题。装甲RNA技术的原理是将特定RNA序列通过RNA病毒或其它生物技术包装在保护性蛋白或多聚分子外壳中，可以稳定并保护核酸免于核酸酶降解。常见实行方式多将包含有大肠杆菌MS2噬菌体的衣壳蛋白基因的序列及外源基因克隆到表达载体中，这一载体能够将外源基因转录成RNA，并利用载体上MS2的外壳蛋白编码基因组装的外壳蛋白将其装配成二十面体RNA病毒结构的RNA-蛋白质复合体，我们称之为装甲RNA假病毒颗粒。

首先，RNA-蛋白质复合体的结构与RNA病毒相似，即都是蛋白外壳包裹核酸，因此可以把内标与病毒材料放在一起，共同经历核酸提取、反转录和PCR扩增，从而对RNA病毒的检测进行全程监控，避免出现假阴性结果。其次，装甲RNA技术得到的病毒样颗粒无传染性，不会对实验人员造成伤害，因此生物安全性较好。最后，由于这种病毒样颗粒具有耐核糖核酸酶的特性，所以作为RNA病毒检测的内标稳定性良好，并且易于保存。

中国专利201510243427.9中公开了一种应用于生物医学临床体外诊断领域中的包含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。该假病毒颗粒是由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹丙型肝炎病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体，且为二十面体；设计并人工合成引物通过重叠剪接PCR的方法得到目的基因MS2，将其连接到质粒pET-32a(+)上得到重组质粒pET-MS2，将所得重组质粒pET-MS2与HCV片段连接得到pET-MS2-HCV重组质粒，将所得pET-MS2-HCV重组质粒导入大肠杆菌进行原核表达，采用超声破碎法释放病毒样颗粒，所得病毒样颗粒即为含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒。

中国专利201810544017.1中公开了肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法，该装甲RNA的表达载体为pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒，该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后，离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒中；该装甲RNA储存时不会受到RNase酶降解，是性能稳定的肠道病毒PCR质控品。

但是现有技术中使用装甲RNA的方法表达包装的假病毒包装效率不高，且假病毒纯化工艺复杂，纯度不高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种假病毒的制备方法，对现有载体进行改造，以获得具有更高包装效率和表达效率的假病毒，以及更简单高效的纯化工艺。本发明提供的假病毒长期保存稳定性有所增强，对假病毒进行冻干，可以在室温保存更长时间。

一方面，本发明提供了一种改造载体。

所述的改造载体中包括以下序列：

(1)优化后的表达衣壳蛋白的DNA序列，所述的DNA序列选自SEQ ID NO.1-6或其变体，优选为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2；

(2)表达成熟蛋白的DNA序列SEQ ID NO.7或其优化后的序列；

(3)包装识别位点SEQ ID NO.8；

(4)His标签SEQ ID NO.9；

(5)IPC靶序列。