[发明专利]一种酿酒酵母大片段基因编辑的方法

权利要求书

1.一种酿酒酵母大片段基因编辑的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴设计GIM基因表达盒

将半乳糖启动子控制的I-SceI基因的表达盒从质粒pGSHU扩增下来，并在上、下游引物中各插入一个I-SceI识别序列，同源臂为52bp；

⑵构建双DSBs突变株

利用PEG/LiAC法向酵母中进行转化，涂布于Hyg筛选板上生长，挑取生长出的单克隆菌株提取基因组，PCR验证；

⑶设计目的基因表达盒

通过重叠延伸PCR，将目的基因与KanMX6筛选标记连接起来，上下游同源臂68bp，该同源臂为双DSBs中上游DSB两端的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母大片段基因编辑的方法，其特征在于：所述步骤⑴中扩增GIM基因表达盒的引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母大片段基因编辑的方法，其特征在于：所述步骤⑴中PCR扩增目的基因，Fastpfu DNA聚合酶PCR反应体系及条件如下：

Fastpfu DNA聚合酶体系：

Fastpfu DNA聚合酶程序设定：

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母大片段基因编辑的方法，其特征在于：所述步骤⑵的具体步骤如下：

1)将待转化菌体接种于YPDA培养基，220r/min，30℃摇床培养过夜；

2)12h后，将活化的菌液再补充YPDA培养基，继续以220r/min，30℃的条件，摇床培养3-4h；

3)将培养的菌液进行离心，3000rpm离心2min；

4)弃掉部分上清，留部分上清，用移液枪吹悬，然后2000rpm离心1min后丢弃全部上清；

5)把鲑鱼精DNA用沸水浴5min，立马放冰上备用；

6)向菌体中加入需要转化的目的基因，即PCR扩增好的I-SceI基因表达盒、鲑鱼精DNA，迅速使用涡旋振荡器振荡混匀；

7)加入40％PEG4000/1×TE-LiAc，移液枪轻轻吹悬混匀；所述40％PEG4000/1×TE-LiAc为按PEG4000:1×TE:LiAc的体积比为8:1:1混合配置得到；

8)加入总体积10％的DMSO，上下颠倒离心管混匀，然后30℃静置30min，恒温孵育器42℃热激15min；

9)3000rpm离心2min，弃去上清；加入无菌水，吹悬混匀；涂布在普通板上生长4-6小时，转印到KanMX6抗性筛选板生长；

10)挑取转化后生长的单菌落，接入YPDA培养基，过夜培养；4500rpm离心2min，弃去上清，吸取菌液，提取基因组DNA，PCR验证。

5.根据权利要求4所述的酿酒酵母大片段基因编辑的方法，其特征在于：所述需要转化的目的基因：鲑鱼精DNA：40％PEG4000/1×TE-LiAc：无菌水的比例μg：μL：μL：μL为0.1-1.0：5：600：100-200。

6.根据权利要求4所述的酿酒酵母大片段基因编辑的方法，其特征在于：所述步骤1)中YPDA培养基的配方为：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，0.03g/L腺嘌呤硫酸。

7.根据权利要求1所述的酿酒酵母大片段基因编辑的方法，其特征在于：所述步骤⑵中Hyg筛选标记是通过引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6从pGSHU质粒上通过PCR扩增下来的。

8.根据权利要求1至7任一项所述的酿酒酵母大片段基因编辑的方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体制备如下：

①扩增待转入的目的片段，称为片段A；

②将KanMX6筛选标记基因从pGSKU质粒上通过PCR扩增下来备用，称为片段B；

③通过重叠延伸PCR将待转入的目的片段即片段A与KanMX6筛选标记基因即片段B连接起来，Fastpfu DNA聚合酶PCR反应具体体系条件及程序设定如下，连接合成的片段称为片段C；

重叠延伸PCR Fastpfu DNA聚合酶体系：

重叠延伸PCR Fastpfu DNA聚合酶程序设定：

④使用上游引物、下游引物将连接合成的片段C进行扩增，提高浓度，Fastpfu DNA聚合酶PCR反应具体体系条件及程序设定如下：

重叠延伸PCR Fastpfu DNA聚合酶体系：

重叠延伸PCR Fastpfu DNA聚合酶程序设定：