[发明专利]可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme及试剂盒

说明书

本发明公开了一种可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme，其序列如SEQ ID No：1所示，以及利用该DNAzyme构建的荧光分子探针体系和试剂盒。本发明通过使用特异性识别刚地弓形虫分泌蛋白ROP的具有RNA酶功能的DNAzyme作为荧光分子探针，可在几分钟之内快速检测出刚地弓形虫。在反应过程中，通过荧光分光光度计的不同荧光通道检测并区分出不同的荧光信号，从而鉴定出不同的病原体。

技术领域

本发明属于大分子检测技术领域，更具体的涉及一种可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme，及其制成的试剂盒和胶体金试纸。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生，机会致病原虫，引起人和动物共患的弓形虫病(toxoplasmosis)。弓形虫可侵犯人体任何器官，其好发部位为脑、眼、淋巴结、心、肺、肝和肌肉，可引起各种疾病，尤其在宿主免疫功能低下时，可致严重后果。WHO数据显示弓形虫的感染呈世界性分布，全球成人感染率从10％到90％不等。弓形虫感染通常是无症状的，据估计，全世界30％的人口遭受刚地弓形虫慢性感染。尽管大多数人在感染后没有表现出明显的症状，但是对那些免疫系统受到抑制的人们(如接受癌症治疗的病人，或者HIV感染者)而言，这种感染可以是威胁生命的。孕妇也能够将感染传播给未出生的孩子，从而让这些婴儿处于患有严重神经疾病的风险之中。除了可导致免疫功能低下的人患上危及生命的疾病之外，它也可导致免疫功能正常的人出现复发性眼部病变。

弓形虫可以引起人和各种动物的传染，传播途径分为先天性和获得性。先天性感染指孕妇通过胎盘传播使胎儿感染。获得性感染传播途径以饮食(生或未熟的肉、乳、蛋等)、水源污染和密切接触动物(猫、猪、犬、兔等)为主。输血或器官移植并发弓形虫病也有报告，经损伤的皮肤黏膜或唾液飞沫传播也有报道。

弓形虫在我国传播广泛，我国阳性感染率为5～20％，部分地区高达30％以上，农村高于城市，成人高于儿童。因此，我国医院已在开展对孕妇普遍进行弓形虫抗体检查。孕期体检中有一项TORCH检查，TORCH中字母T就代表弓形虫。但检查的质量不高，试剂质量和筛检方法有待标准化，许多临床医生对血清学检查结果的意义和正确判断也不熟悉。检验质量不高造成的假阳性结果和医生解释错误，不仅浪费病家钱财，而且引起病人和家属无谓的焦虑不安，带来很大精神负担，甚至做了不该做的人工流产，造成难以弥补的损失。

弓形虫不仅宿主很多，而且人和人之间也可以互相传染，大多数人都是弓形虫带虫者，形成带虫免疫。患弓形虫病人的尿液，唾液、眼泪、鼻涕、带有弓形虫包囊。急性发作的病人的喷嚏，可以成为飞沫传染源。人吃感染动物的肉，是传染的主要原因。弓形虫可以污染草原、牧场、土壤、水，在外界环境的生存时间可以很长，在潮湿土壤里可活数月乃至数年。随着社会的发展，养宠物的人越来越多，人和动物的关系越来越密切，弓形虫也成为最重要的人畜共患病原体之一，威胁着人类的健康。面对严重威胁人类安全与发展的人畜共患病，相对于个人的自我防护，更为重要的是对各种人畜共患病进行控制，做到早发现、早报告、早处理，严格防止某些疾病的暴发和传播。及时的检测就尤为重要。

目前，弓形虫病的实验室诊断包括病原学检查、免疫学诊断和分子生物学检测。病原学检查主要包括组织学诊断、动物接种分离法和细胞培养法。常用的血清学诊断方法有染料试验、间接血凝试验、间接免疫荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验。分子诊断包括PCR技术及核酸杂交技术等。但这些方法基本局限在实验室检测层面。

因此，开发一种弓形虫的快速、准确的检测方法对弓形虫的筛查和现场检测具有巨大的社会意义，可以实现随时随地的检测，对弓形虫的防治意义重大。

近年来，基于核酸适配体的检测技术发展迅速。作为通过SELEX体外筛选技术人工筛选得到的，能与相应配体专一性紧密结合的一类只有几十个核苷酸长的单链核酸分子(一般20～100nt)，核酸适配体不但和抗体一样能与靶标分子特异性结合，而且还有许多抗体无法比拟的优点，比如可任意人工合成、成本低、稳定性强、易修饰等。