[发明专利]一种生物法生产L-5-甲基四氢叶酸的方法

权利要求书

1.一种生物法生产L-5-甲基四氢叶酸的方法，步骤是：

（1）构建产L-5-甲基四氢叶酸（L-5-MTHF）的工程菌：

a. 以大肠杆菌E. coli BL21(DE3)基因组为模板扩增SEQ ID NO.3所示的二氢叶酸还原酶基因folA以及SEQ ID NO.4所示的亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF，将folA基因和metF基因克隆到pACYCDuet-1载体的两个多克隆位点上，构建重组质粒，命名为pACYCDuet-metF-folA；以自产乙醇梭菌（C. autoethanogenum）基因组为模板扩增SEQ ID NO.5所示的甲酸四氢叶酸连接酶、甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fhs-fchA-folD，将fhs-fchA-folD基因克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet-WL；以扭脱甲基杆菌（M. extorquens）AM1基因组作为模板扩增SEQ ID NO.6所示的甲酸四氢叶酸连接酶基因ftfL以及SEQ ID NO.7所示的甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fchA-mtdA，将ftfL、fchA和mtdA克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet-C1T；

b. 将质粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-WL共同转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L-5-MTHF的工程菌，命名为BL21-WL；将质粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-C1T共同转化到敲除甲硫氨酸合成酶基因（metH）的E. coli BL21(ΔmetH)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L-5-MTHF的工程菌，命名为BL21(ΔmetH)-C1T；

（2）产L-5-MTHF的工程菌发酵：

将产L-5-MTHF的工程菌BL21-WL菌株或BL21(ΔmetH)-C1T菌株以体积比1~5%的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的发酵培养基中，在37±1℃和180~220 rpm转速条件下培养2~4小时至OD600nm为0.6~1.0，获得菌液；向制得的菌液中加入终浓度为0.4~0.8 mM 的IPTG，在20~37℃、100~120 rpm转速下诱导8~16小时，然后将培养液离心收集菌体，即获得含L-5-MTHF的工程菌细胞；

其中，上述发酵培养基的配方及组分终浓度是：胰蛋白胨 10~15 g∙L-1，酵母粉 20~30g∙L-1，甘油 2~5 ml∙L-1，叶酸 0.01~0.4 g∙L-1，甲酸钠 0.1~4.0 g∙L-1，KH2PO4 2~4 g∙L-1，K2HPO4 12~14 g∙L-1；氨苄青霉素终浓度为50 µg∙ml-1，氯霉素的终浓度为25 μg∙ml-1；

（3）破碎工程菌细胞，释放出L-5-MTHF：

将离心后获得的工程菌细胞在厌氧箱中用含0.1%的抗坏血酸和含0.1%巯基乙醇的50mM pH 7.2 的经煮沸后脱气厌氧处理的Tris-HCl溶液重悬，密封在厌氧小瓶中，100℃水浴煮沸10 min破碎细胞，即得含L-5-MTHF的细胞破碎液，立即将其冰浴，并于15,000 rpm，4℃离心15 min后收集上清，再加入新鲜小鼠血清至100 µl∙ml-1，37℃反应3 h，煮沸5 min终止反应，离心取上清，用0.22 µm的醋酸纤维素滤膜过滤，滤液装入液相小瓶；

（4）使用201×7强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂纯化L-5-MTHF，并使用高效液相色谱（HPLC）对L-5-MTHF产量进行测定：

其中L-5-MTHF的纯化方法是：用1 M的NaOH和1 M的HCl处理强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂2次，超纯水洗至中性，再用1 M的NaOH浸泡树脂24 h，将其转变为OH型，用超纯水洗至中性，用50 mM pH 7.2的Tris-HCl缓冲液平衡柱子至流出液与缓冲液pH值相同，将步骤（3）液相小瓶中的滤液样品在避光条件下上样，用0.1 M pH 7.2的NaCl洗脱，紫外检测器在290 nm下检测并收集洗脱液；

其中HPLC对L-5-MTHF测定的方法是：荧光检测器Ex=290 nm, Em=356 nm，以体积比为93:7的33 mM pH 3.0磷酸钾和乙腈为流动相，上样量20 µl，走样时间30 min，柱温箱温度为30℃，保留时间为19.3±0.1min。