[发明专利]一种检测致病性细菌的探针组合、芯片、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种探针组合，属于微生物检测技术领域。其中，所述探针组合包括检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和宋内氏志贺氏菌中的至少两种致病细菌的探针。本发明还公开了利用上述探针组合制备的基因芯片、试剂盒和检测方法。利用本发明对4种食源性致病细菌进行检测，特异性强、灵敏度高，准确性好，并且方便、快速，尤其适用于细菌浓度低的样本检测，为感染诊疗和食品安全检测提供更好的技术支持。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测致病性细菌的探针组合、芯片、试剂盒及方法。

背景技术

食源性细菌感染病是当今世界上最关注的公共卫生问题之一，是由细菌通过多种途径污染食品和饮水后，因食用被食源性致病细菌污染的食物和水而进入人体，引起人的食源性感染病。近年来，由于全球性食品贸易的快速增长，导致食源性细菌感染引发的细菌性疾病不断发生，且细菌耐药性的形势日益严峻，面对很多食源性细菌感染性疾病(特别是超级耐药细菌)常常束手无策，已危及到食源性致病菌的控制。

食源性致病细菌主要包括致病性大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、志贺氏菌和布鲁氏菌等。传统的食源性致病细菌的检测技术有细菌培养、细菌免疫学检测等，传统的方法操作复杂、周期过长、阳性率低等局限，不能满足食品安全快速检测的需求，也不利于食源性致病细菌感染等事件的处理。而近年来发展了一系列病原体核酸分子检测技术，包括PCR、基因芯片、高通量测序基因检测等。PCR具有较好的特异性及灵敏度，但每次只能检测一种致病菌，存在通量低的缺陷，而二代测序技术虽然检测的病原范围大，但周期较长(24h以上)、灵活度低、成本高、整个过程比较复杂，尤其是数据的解读，目前仍然存在一定的困难。而基因芯片既具备高灵敏性和特异性，且成本较低、操作灵活、时效性高、针对性强，使得其十分适用于对特定类型样本的病原检测，适合临床和食品安全检测的应用。

基因芯片(GeneChip)又称为微阵列技术(MicroArray)，主要包括5个技术环节：探针构建、芯片制备、样品制备、芯片实验、信号检测及结果判读。基因芯片上的探针设计是体现芯片检测效能的核心因素之一，然后现有的特异性探针序列设计算法均从微生物的保守基因如细菌的16SrRNA、真菌的ITS等进行挖掘，且采用长序列比对的方式，故算法程序缺乏足够的灵活性，且探针序列缺乏足够的覆盖度和灵敏性。不能满足大规模的细菌检测基因芯片的设计要求。此外，现有的芯片设计方法未考虑微阵列上荧光信号的区域不均匀性而对各类探针的排布进行设计，现有的芯片设计方法缺乏荧光信号的标准化处理。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采用的技术方案如下：

一种探针组合，所述探针组合包括检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和宋内氏志贺氏菌中的至少两种致病细菌的探针。

大肠埃希菌(Escherichia coli)是革兰氏阴性兼性厌氧菌，是人的条件致病菌，是人体肠道的正常菌群和医院获得性感染的常见病原之一。当机体免疫力低下时，食用/饮用被污染的食物或饮用水而引起腹腔感染、肠道道感染和血流感染等感染疾病。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种食源性条件致病菌，人感染金黄色葡萄球菌后主要引起恶心、呕吐、腹部痉挛、水性或血性腹泻等胃肠道症状，严重者可引起局部化脓感染，如肺炎、盆腔炎、心包炎，甚至败血症、脓毒症等全身性感染。

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种兼性厌氧，革兰氏阳性细菌。主要分布于自然界土壤、腐烂的植物以及动物粪便中。该菌是条件致病菌，免疫力低下人群常因食用/饮用被污染的食物或饮用水而引起脑膜脑炎、肝炎、脊髓炎和急慢性肝炎等。

宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)是革兰氏阴性，无运动性，无孢子形成的兼性厌氧菌，该菌会引起腹泻和尿毒症痢疾和脑病等疾病。