[发明专利]靶向人NK细胞的腺病毒载体及其应用

说明书

本发明提供一个fiber改造的人5型腺病毒（HAdV‑5）质粒及HAdV‑5 fiber改造方法。这个HAdV‑5腺病毒质粒命名为pKAd5f11p228R‑EG；含有E1/E3缺失的HAdV‑5基因组；原E1区位置含有人EF1a启动子控制的绿色荧光蛋白（GFP）基因表达框，GFP编码区两侧分别含有一个限制性内切酶PmeI酶切位点；原HAdV‑5 fiber基因被替换为人工改造的f11p228R基因，f11p228R基因编码HAdV‑5 fiber的tail结构域，HAdV‑11p fiber的shaft和knob结构域，并且其编码的蛋白氨基酸序列228位之后插入有RGD4C短肽序列（CDCRGDCFC）。该腺病毒质粒可以直接用于拯救携带GFP基因的人原代NK细胞靶向重组HAdV‑5，也可以作为构建携带其他目的基因、人原代NK细胞靶向HAdV‑5病毒的起点质粒。预计该质粒可以用于制备人原代NK细胞靶向基因转移载体或基因转导试剂盒。

技术领域

本发明属于细胞治疗和基因治疗领域，具体而言，本发明涉及靶向人NK细胞的人5型腺病毒载体及其应用。

背景技术

免疫系统在恶性肿瘤的生长和进展中发挥重要作用。新近的研究通过检测肿瘤患者免疫系统的改变，制定提高免疫系统肿瘤杀伤能力的策略，开发了一系列过继细胞疗法(adoptive cell therapies, ACTs)。尤其是对嵌合抗原受体T细胞 (chimeric antigenreceptor Tcell,CAR-T)的研究，极大地改变了许多癌症患者的预后。但CAR-T细胞疗法有几个缺点：个体化疗法细胞生产非常耗时；需要先进的技术支持，费用昂贵；对病人具有显著的毒副作用，甚至会引起患者死亡^[1]。CAR-T 细胞毒性可分为两类，包括与 T 细胞活化和随后系统性高水平细胞因子释放相关的一般毒性，以及CAR 与机体正常细胞表达的靶抗原特异性结合导致的毒性（肿瘤外靶向效应）^[2]。鉴于这些原因，用自然杀伤细胞（naturalkiller cell,NK细胞）替代T细胞，即CAR-NK疗法，将是一种更好的替代方案。CAR-NK保持了CAR-T的有效性，又没有其缺点。CAR-NK 细胞疗法不受 HLA（人类白细胞抗原）或 KIR（杀伤性 Ig 样受体）相容性限制，不会产生严重的毒性；NK来源广泛，能够大规模制备，可以作为现货产品（off-the-shelf），需要时直接使用。因此作为CAR-T疗法的天然继任者，CAR-NK疗法正成为研究热点^[3]。

在NK细胞表达嵌合抗原受体（CAR），使其成为CAR-NK，需要对NK细胞进行转基因修饰才能实现。目前针对NK细胞的基因转导方法主要分为2类：基于病毒载体的基因转导和基于电穿孔的基因转导^{[4, 5]}。常用的逆转录病毒或慢病毒载体对NK细胞的基因转导效率一般低于15%。电穿孔（electroporation）方法对细胞伤害大，将造成部分细胞死亡，使用转座子（transposon）质粒对NK细胞进行电转化，外源基因转导效率在15%左右；直接使用mRNA进行电转化，外源基因表达效率能够达到40%，但表达周期较短。可见CAR-NK细胞治疗亟需更高效的外源基因转导方法。

腺病毒载体是基因治疗常用载体。其外源基因载量大，表达效率高；既感染分裂期细胞也可以感染非分裂期细胞；腺病毒是无包膜病毒，理化性质稳定，容易制备和纯化，保存周期长；病毒基因组不整合到宿主细胞染色体，安全性好。腺病毒载体在基因治疗和重组疫苗领域已得到广泛应用^{[6, 7]}。但常用的人5型腺病毒（humanadenovirus 5, HAdV-5）载体对造血细胞的基因转移效率低，未见使用腺病毒载体转导人原代NK细胞的研究报道。

虽然腺病毒载体是瞬时表达载体，但其对NK细胞的基因转导仍然具有重要意义。因为与CAR-T不同，CAR-NK细胞治疗可以是一个短期过程，并不一定需要细胞进行长期的分裂增殖。相反，对NK细胞的瞬时转基因还可能成为一种优势，因为治疗的安全性会提高。