[发明专利]一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物、方法及应用

权利要求书

1.一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物为包括正向引物D.sp-29和反向引物D.sp-485的第一对引物或包括正向引物D.sp-140和反向引物D.sp-506的第二对引物，其序列分别为：

D.sp-29：5′-CCCTTTGTGAACTTATACCTT-3′；

D.sp-485：5′-CAGGGCACCGCCAGGGCCTTCCAG-3′；

D.sp-140：5′-TTGTTTTTACACTGAAACTCTG-3′；

D.sp-506：5′-AAGTTGGGGGTTTAACGGCA-3′；

所述第一对引物针对拟茎点霉属特异性扩增片段大小为456bp，所述第二对引物针对拟茎点霉属特异性扩增片段大小为366bp。

2.一种采用如权利要求1所述的特异性引物PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提取待检测样品DNA；

S2：以待测样品为DNA为模板，分别采用两对引物进行PCR扩增；

S3：扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。

3.如权利要求2所述的一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的方法，其特征在于，所述步骤S1中提待检测样品DNA的具体步骤如下：

S11：称取待检测样品1g左右，加液氮在研钵中用研磨棒研磨成细末，将细末转移至离心管中，加入600μL预热至65℃的2×CTAB，颠倒混匀，65℃水浴45～60min；

S12：取出离心管冷却至室温，加入600μL氯仿：异戊醇溶液，振荡混匀，10000rpm离心10min，取上清液加入等体积氯仿：异戊醇溶液，10000rpm离心10min；

S13：取上清液置于离心管中，加入0.6倍体积的预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置1h，10000rpm离心10min；

S14：去掉上清液，加入70％无水乙醇清洗2次，室温干燥后用适量无菌ddH₂O溶解沉淀的DNA，-20℃保存备用。

4.如权利要求3所述的一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的方法，其特征在于，所述步骤S11中的2×CTAB含2％巯基乙醇和2％的PVPP。

5.如权利要求2所述的一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增的反应体系总体积为25μL，包括10×Taq PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌ddH₂O 13μL。

6.如权利要求2所述的一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃总延伸5min。

7.如权利要求2所述的一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的方法，其特征在于，所述步骤S3中琼脂糖凝胶电泳采用1％的琼脂糖凝胶，采用120V恒压电泳15min。

8.一种如权利要求1所述的PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物在猕猴桃软腐病的早期检测中的应用。