[发明专利]一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制、实验方法及应用

权利要求书

1.一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制，其特征是，Agrin促进DOK7泛素化，并通过蛋白酶体系统降解，最终导致DOK7蛋白水平下调，实现对Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控。

2.根据权利要求1所述的一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制，其特征是，MuSK能够促进DOK7的泛素化与降解；MuSK调控DOK7泛素化依赖自身激酶活性以及与DOK7的结合。

3.根据权利要求1所述的一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制，其特征是，DOK7的泛素化位点是DOK7第243位赖氨酸；DOK7 Lys243的泛素化负调控AChR的聚集。

4.根据权利要求1所述的一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制，其特征是，过表达APC2促进DOK7泛素化与降解；DOK7泛素化依赖自身第106位酪氨酸磷酸化；DOK7Tyr106磷酸化促进DOK7二聚体化。

5.根据权利要求1所述的一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控方法，其特征是，

Agrin刺激肌管激活MuSK后，MuSK促进DOK7 Tyr106发生磷酸化，在CDH1的帮助下，APC2与Tyr106磷酸化的DOK7结合并介导DOK7 Lys243发生以K48连接方式为主的泛素化，促进DOK7通过蛋白酶体系统降解，最终导致DOK7蛋白水平下调，实现对Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控。

6.一种研究Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制的实验方法，其特征是，所述实验方法能够用于研究权利要求1-5所述的负调控方法，包括：

(1)在体外模拟体内的Agrin-MuSK-DOK7信号通路激活过程，用Agrin刺激C2C12分化的肌管，在不同的刺激时间点收集样品进行Western blot检测；

(2)采用Q-PCR检测Agrin刺激前后的LRP4，MuSK和DOK7的mRNA水平；

(3)在Agrin刺激肌管前，预先用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬-溶酶体抑制剂CQ处理肌管1h，然后再用Agrin刺激肌管后收样进行Western blot检测。

7.根据权利要求6所述的一种研究Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制的实验方法，其特征是，通过转染泛素野生型质粒、只保留第48位赖氨酸而其余六个赖氨酸均突变为精氨酸的泛素突变体质粒和只保留第63位赖氨酸而其余六个赖氨酸均突变为精氨酸的泛素突变体质粒来检测DOK7泛素化的泛素连接方式。

8.根据权利要求6所述的一种研究Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制的实验方法，其特征是，对DOK7 Tyr106磷酸化是否调控APC2^CDH1对DOK7的底物识别进行检测：在HEK293T细胞转染相应的质粒，转染24h后收样，用GFP抗体对GFP-DOK7进行co-IP，再用Flag抗体检测co-IP产物中与DOK7结合的APC2蛋白水平。

9.根据权利要求6所述的一种研究Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制的实验方法，其特征是，对Agrin是否调控肌管内源性DOK7与APC2的结合进行检测：用DOK7的抗体co-IP，再用APC2抗体检测co-IP产物中与DOK7结合的APC2蛋白水平。

10.一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制在维持正常的AChR聚集与神经肌肉接头发育中的应用。