[发明专利]一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白

说明书

本发明公开了一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，其含有抗生素耐药基因的结合位点，还含有通过ZF linker串联的锌指结构，并在其N端和C端连接有蛋白骨架。本发明还公开了所述蛋白在水环境中去除抗生素耐药基因中的应用，其中所述抗生素耐药基因优选磺胺类耐药基因sul1。实验证实本发明的蛋白能够特异性结合水环境中的抗生素耐药基因sul1，在模拟实际应用中的结合效率达到50％，预示其在水环境中对抗生素耐药基因的去除发挥显著作用，为解决无法在水环境中特异性去除耐药基因的不足奠定了实施基础，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

水环境中抗生素耐药基因的处理技术目前尚有许多不足，传统的污水处理技术(过滤，沉淀，厌氧消化)只能对水环境中的微生物和污染物进行去除，并不能去除其中的耐药基因；包括紫外线在内的氧化及高级氧化技术所需紫外的剂量很高，且不具备选择性；膜技术通过孔径大小对水环境中的污染物和耐药基因进行截留，使用过程中膜结垢问题严重且成本较高；电化学技术则需持续施加电场。

通过研究生物体内能够结合DNA的蛋白质的结构和功能之间的关系，人们开发了设计并合成能够结合特异序列DNA的技术。这些技术被用于体内基因编辑，实现了高效的基因组改造。锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)技术是基于锌指结构域设计的一种DNA结合与剪切技术。目前开发了可以特异性识别结合49种三联核苷酸(共有64种组合)的锌指结构域(Zinc Finger，ZF)。通过将识别不同三联核苷酸的ZF串联，人们可以构建出能够结合大多数特异DNA片段的人工蛋白。使用这一技术，可实现特异性地靶向结合DNA片段，使得利用该技术在水环境中特异去除抗生素耐药基因而不影响其他基因成为可能。经检索，有关能够特异性结合抗生素耐药基因sul1的新型人工合成蛋白及其应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白及其应用。

本发明所述的能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，其特征在于：所述蛋白含有抗生素耐药基因的结合位点，还含有通过ZF linker串联的锌指结构，并在其N端和C端连接有蛋白骨架。

上述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白优选的实施方式是：所述人工合成蛋白含有能够特异性识别抗生素耐药基因sul1的结合位点，还含有通过ZFlinker串联的6个锌指结构，并在其N端和C端连接有SP1C蛋白骨架，该人工合成蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该人工合成蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述抗生素耐药基因sul1结合位点的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述SP1C蛋白骨架是：N-term backbone：YKCPECGKSFS，C-term backbone：HQRTH，ZF linker：TGEKP，N-termfixed：LEPGEKP，C-term fixed：TGKKTS。

上述能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白的获取方法是：先对耐药基因sul1特异结合位点序列进行筛选确定，得到相应的锌指结构，并将锌指结构进行串联，并在N，C端连接蛋白骨架，将编码该蛋白的核酸进行人工合成，然后通过酶切连接的方法将其连接到表达载体pET-21b，并转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达，最后通过镍柱亲和层析，离子交换层析方法分离获得高纯度能在水环境中去除抗生素耐药基因的人工合成蛋白，命名为sul1结合蛋白。进一步经EMSA和ITC实验证实该人工合成蛋白可以和sul1基因特异结合。