[发明专利]一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法

权利要求书

1.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，包括磁性纳米颗粒溶液、螯合树脂悬浮液、蛋白酶K溶液、洗涤液以及洗脱液，其中，所述磁性纳米颗粒经过有效的壳聚糖修饰和预处理，通过控制溶液适度pH值实现吸附、解吸核酸，所述螯合树脂用于机械裂解细胞和特异性吸附非核酸杂质的双重功能，所述洗涤液用于洗涤磁性纳米颗粒并吸弃溶液中的蛋白质、脂质、细胞碎片，所述洗脱液用于使吸附于所述磁性纳米颗粒的核酸充分释放，以得到核酸溶液。

2.如权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为壳聚糖修饰的四氧化三铁磁性纳米微球。

3.如权利要求2所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述纳米微球基质为四氧化三铁，表面基团为环氧基团，粒径为200-300nm。

4.如权利要求2或3所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述壳聚糖修饰的四氧化三铁磁性纳米微球是以壳聚糖修饰液涡旋处理四氧化三铁磁性纳米微球12-15小时得到的。

5.如权利要求4所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述壳聚糖修饰液是将低分子量壳聚糖，脱乙酰度≥95％，溶解于1％的乙酸溶液中配制成1％的壳聚糖乙酸溶液，再用去离子水稀释壳聚糖乙酸溶液至0.1％后，用1M NaOH调节溶液pH为9得到的。

6.如权利要求1至5任一项所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，采用如下配置中的任一种或多种：

所述磁性纳米颗粒溶液含有：浓度为5mg/mL的磁性纳米颗粒；浓度10mM的Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为8.0；体积百分比浓度为0.1％的TritonX-100；

所述螯合树脂悬浮液中固体颗粒为Chelex-100弱阳离子螯合树脂，所述Chelex-100基质为聚苯乙烯二乙烯基苯，还含有10mM的Tris-HCl(pH为8.0)，质量体积浓度为20％；

所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL；

所述洗涤液为浓度为10mM Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为7.4；

所述洗脱液含有浓度10mM Tris–HCl和浓度1mM EDTA，所述洗脱液的pH为8.5。

7.如权利要求1至5任一项所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液。

8.如权利要求7所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为浓度为10mM Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为6.8。

9.一种核酸提取方法，其特征在于，使用如权利要求1至8任一项所述的核酸提取试剂盒，所述方法包括如下步骤：

加入样本和螯合树脂悬浮液混匀震荡并加热，利用螯合树脂机械裂解细胞和特异性吸附非核酸杂质；

混合溶液离心后取上清液加入磁性纳米颗粒溶液和蛋白酶K溶液混匀并震荡，利用蛋白酶K降解残余蛋白质，利用磁性纳米颗粒吸附核酸；

加入洗涤液，洗涤磁性纳米颗粒并吸弃溶液中的蛋白质、脂质、细胞碎片；

加入洗脱液使吸附于磁性纳米颗粒的核酸充分释放，得到核酸溶液。

10.如权利要求9所述的核酸提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)一个对细胞裂解和特异性吸附非核酸有机杂质的步骤：在1.5ml离心管中加入200μL细胞样本和200μL螯合树脂悬浮液、充分颠倒混匀，置于95℃裂解10分钟，期间多次将混合溶液涡旋震荡处理保证螯合树脂对细胞的裂解和对非核酸杂质的特异性吸附；

(2)一个有机杂质分离的步骤：将步骤(1)中混合液体以5000rpm的转速离心2分钟，吸取上清液至另一新1.5ml离心管中；

(3)一个对核酸分子吸附并进一步去除组蛋白的步骤：向步骤(2)中的离心管中加入50μL磁性纳米颗粒溶液、20μL蛋白酶K溶液和250μL缓冲液颠倒混匀，置于室温孵育5分钟，期间多次将混合溶液涡旋震荡处理保证磁性纳米颗粒对核酸的充分吸附；

(4)一个去除杂质的步骤：将步骤(3)中的离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后吸去液体，加入500μL洗涤液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡混匀3分钟；

(5)一个对核酸分子洗脱的步骤：将步骤(4)中的离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后吸去液体，加入200μL洗脱液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡混匀3分钟；

(6)一个对提纯后核酸溶液收集的步骤：将步骤(5)中的离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后，将提取完成的核酸溶液转移到新的离心管中。