[发明专利]促使iPSC分化为中枢神经元细胞的方法及培养基和系统

权利要求书

1.一种促使诱导多能干细胞分化为中枢神经元细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：诱导多能干细胞的培养；

包括原代培养和传代培养，所述原代培养和所述传代培养中所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；

S2：诱导多能干细胞分化为中枢神经干细胞；

开始分化前，将诱导多能干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用低动物源性中枢神经诱导培养基1或无动物源性中枢神经诱导培养基1进行培养，更换培养基，培养8～10天，以胰酶替代物对诱导多能干细胞分化后得到的中枢神经干细胞进行处理，收集中枢神经干细胞；

S3：中枢神经干细胞进一步分化为中枢神经元细胞；

将中枢神经干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用低动物源性中枢神经诱导培养基2或无动物源性中枢神经诱导培养基2进行培养，每隔24～36小时更换培养基，在培养1～4天后对中枢神经元细胞进行分析，检测其纯度和产量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中所述原代培养和/或所述传代培养中诱导多能干细胞的接种密度为1.0～2.5×10⁴个/cm²，优选为1.5×10⁴个/cm²。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中所述诱导多能干细胞的接种密度为1.5～3.5×10⁴个/cm²，优选为2.5×10⁴个/cm²。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述中枢神经干细胞的接种密度为1.0～3.0×10⁴个/cm²，优选为3.0×10⁴个/cm²。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中所述低动物源性中枢神经诱导培养基1包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、B27、胰岛素、全铁转铁蛋白、黄体酮、腐胺、LDN193189、SB431542、XAV-939。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中所述无动物源性中枢神经诱导培养基1包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、LDN193189、SB431542、XAV-939。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述低动物源性中枢神经诱导培养基2包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、B27、胰岛素、全铁转铁蛋白、黄体酮、腐胺、脑源性神经营养因子、神经生长因子、PD0325901、SU5402。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述无动物源性中枢神经诱导培养基2包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、脑源性神经营养因子、神经生长因子、PD0325901、SU5402。

9.一种促使诱导多能干细胞分化为中枢神经元细胞的低动物源性中枢神经诱导培养基，其特征在于，包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、B27、胰岛素、全铁转铁蛋白、黄体酮、腐胺、脑源性神经营养因子、神经生长因子、PD0325901、SU5402。