[发明专利]一种利用微球菌制备烟草提取物的方法

权利要求书

1.一种利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02单菌落接种至液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，制得种子液；

步骤(2)：将种子液在4000r/min，4℃的条件下低温离心20min，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD₆₀₀为2.0，制得微球菌种子；

步骤(3)：将烟末与去离子水按照质量比1:(2-20)混合，在30℃-100℃下提取0.5h-5h，过滤后取滤液经灭菌处理，得到烟草浸提液；

步骤(4)：将微球菌种子与烟草浸提液按照体积比1:(50-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min的条件下搅拌发酵1-5d，得到发酵液；

步骤(5)：对发酵液进行离心处理，将上清液分离纯化，采用不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液；

步骤(6)：在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，低温静置一段时间后，离心取上清液，得到醇沉物；

步骤(7)：在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的1％-50％的1,2-丙二醇，即得到烟草提取物。

2.根据权利要求1所述的利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的液体培养基为LB液体培养基。

3.根据权利要求1所述的利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养的条件如下：

温度为30℃，震荡速度为150r/min，时间为12h。

4.根据权利要求1所述的利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体如下：

将烟末过筛，过筛后的烟末与去离子水按照质量比1:(2-20)混合，在30℃-100℃下提取0.5h-5h，过滤后取滤液，121℃灭菌10min，得到烟草浸提液。

5.根据权利要求1所述的利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体如下：

将微球菌种子与烟草浸提液按照体积比1:200混合，在温度30℃、150r/min的条件下搅拌发酵2d，得到发酵液。

6.根据权利要求1所述的利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体如下：

对发酵液进行离心处理，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为10-100％的至少两种不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，真空浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

7.根据权利要求6所述的利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体如下：

将发酵液在转速4000r/min、温度4℃条件下离心30min，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为10-100％的至少两种不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，在温度50℃、真空度为150mbar条件下浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

8.根据权利要求6所述的利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(5)中采用体积分数为50％、70％和80％的乙醇梯度洗脱。

9.根据权利要求1所述的利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(6)具体如下：

在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，-20℃温度下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

10.根据权利要求1所述的利用微球菌制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(7)具体如下：

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，即得到烟草提取物。