[发明专利]大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体的制备及应用

说明书

本发明公开了大肠杆菌L‑谷氨酸脱羧酶突变体的制备及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明提供的大肠杆菌L‑谷氨酸脱羧酶突变体G125F、S126G、S273F、S273G、L276A、G125F/S273F、S273F/L276A、L276A/G125F、G125F/S273F/L276A，所述突变体的大肠杆菌L‑谷氨酸脱羧酶活性比野生型分别提高了20％、19％、36％、13％、29％、42％、46％、41％、53％；GABA的产量较野生型提高了29g/L、27g/L、51g/L、15g/L、34g/L、77g/L、95g/L、72g/L、127g/L，最高可达694g/L。GABA产量的提高更有利于扩大其工业化应用范围。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体的制备及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种天然的、四碳非蛋白氨基酸，也称γ-氨酪酸，分子式为C₄H₉NO₂，相对分子质为103.12，由谷氨酸(Glutamic acid，Glu)经谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)催化而来。由于具有降血压、抗抑郁、抗焦虑、改善脑机能等多种生理功能。近来发现GABA还具有抑制肿瘤细胞增殖、改善脑血栓、降低1型糖尿病等功能。尽管GABA具有诸多功能性，但是人体内GABA含量会随着人的年龄以及外界环境压力的增加而日益减少，因此在日常饮食中补充GABA对改善人体健康具有要意义。

GABA生产方法主要有3种，分别是化学合成法、植物富集法、微生物发酵法，它们在实际生产中的应用各不相同。动植物体中天然存在的GABA含量较低导致生产成本较高，因此需要开发GABA的高效生产方法。目前GABA制备方法以化学合成法和微生物合成法为主。化学合成法生产制备GABA的工艺有很多，其工艺生产的GABA纯度高，但生产过程能耗高，对温度要求严格，污染环境，安全性差，成本高，不符合绿色生产的理念，因此这些生产工艺不被业内所推崇。微生物发酵法是利用微生物体内的L-谷氨酸脱羧酶将L-Glu或其盐脱羧转化成GABA，该方法具有专一性高、设备简单、环保、成本低、生产菌种多样且易获得等优点，但是天然L-谷氨酸脱羧酶活和催化稳定性较差，还不能够适用于大规模产业化生产。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶的活性，提高GABA的产量，为扩大其工业化应用创造条件。

本发明提供了大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体，所述突变体是将E.coli BL21(DE3)来源的大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)为亲本，在亲本第125位、126位、273位或276位的一个或多个多位突变体。

在一种实施方式中，所述E.coli BL21(DE3)来源的大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第125位甘氨酸(Gly)突变为苯丙氨酸(Phe)，并将突变体命名为G125F。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第126位丝氨酸(Ser)突变为谷氨酸(Gly)，并将突变体命名为S126G。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第273位丝氨酸(Ser)突变为苯丙氨酸(Phe)，并将突变体命名为S273F。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第273位丝氨酸(Ser)突变为谷氨酸(Gly)，突变体命名为S273G。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第276位赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)，突变体命名为L276A。