[发明专利]一种基于TALE组装的线粒体DNA编辑系统

权利要求书

1.一种基于TALE组装的线粒体DNA编辑系统，包括RVD文库、线粒体定位骨架载体、细胞核定位骨架载体，RVD文库有192个RVD模块，包括：160个双RVD模块、16个单RVD模块及16个半RVD模块，其中：

160个双RVD的序列如Seq ID NO：1-160所示；16个单RVD的序列如Seq ID NO：161-176所示；16个半RVD的序列如SeqIDNO：177-192所示；

所述线粒体定位骨架载体的主要元件及结构从5’端到3’端依次为线粒体定位信号（MTS）、ccdb毒素基因、half DddA_tox、尿嘧啶糖基化酶抑制基因（UGI）、氨卞青霉素抗性元件；4个线粒体定位骨架载体其核苷酸序列如Seq ID NO：193-196所示；

所述细胞核定位骨架的主要元件及结构从5’端到3’端依次为细胞核定位信号（NLS）、ccdb毒素基因、half DddAtox、尿嘧啶糖基化酶抑制基因（UGI）、氨卞青霉素抗性元件；4个细胞核定位骨架其核苷酸序列如Seq ID NO：197-200所示。

2.根据权利要求1所述的线粒体DNA编辑系统，其特征在于：双RVD模块识别2个连续DNA碱基，从位置1到10，共有10个位置顺序，每个位置上有16种组合，因此共有160个双RVD模块；单RVD模块识别1个DNA碱基，从位置7-10，共有4个位置顺序，每个位置上有4种可能，因此共有16个单RVD模块；半RVD模块识别1个DNA碱基，位置为8-11，共有4个位置顺序，每个位置上有4种可能，因此共有16个半RVD模块。

3.根据权利要求2所述的线粒体DNA编辑系统，其特征在于： RVD文库中不同位置的双、单和半RVD载体序列，其在BsaI限制性内切酶切割后产生具有位置特异性的粘性末端序列，可使RVD序列按位置顺序自动排列组装，可以组装成识别14-21个碱基的TALE。

4.根据权利要求1所述的线粒体DNA编辑系统，其特征在于：4个线粒体定位骨架载体和4个细胞核定位骨架载体的毒素基因ccdb两侧含有两个BsaI酶切位点，酶切后产生不同的粘性末端用于特异性连接1号位置的双RVD模块和8-11号位置的半RVD模块。

5.一种不包括疾病的诊断与治疗目的的采用权利要求1所述基于TALE组装的线粒体DNA编辑系统的编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、根据所要编辑位点的DNA序列，设计TALE序列，选择权利要求1所述的RVD模块与骨架载体，通过Golden Gate克隆法一步完成载体组装，形成胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）；组装完成的DdCBE载体经过转化DH5α感受态、单克隆PCR验证、Sanger测序步骤后，可获得正确组装的DdCBE载体；

步骤2、将正确组装的MTS-DdCBE转染所要编辑物种的细胞，或NLS-DdCBE与含有编辑位点的T载体共同转染HEK293FT细胞，通过Sanger测序或高通量测序检测DdCBE编辑效率，筛选对线粒体DNA或T载体编辑效果最好的DdCBE组合；

步骤3、将编辑效果最好的DdCBE进行体外转录，注射1细胞期受精卵，然后将胚胎移植到受体动物输卵管，或通过体外发育获得F0代动物；通过Sanger测序及高通量测序检测F0代的编辑效率，筛选高编辑效率的F0代动物；

步骤4、将高编辑效率的雌性F0代动物与野生型雄性动物交配，获得的F1代动物通过Sanger测序及高通量测序检测编辑效率。