[发明专利]DSC2基因敲除小鼠模型的构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种DSC2基因敲除小鼠模型的构建方法和应用，DSC2基因敲除小鼠模型在制备预防和治疗右心病、监测右心室舒张和收缩、制备凋亡通路调控试剂和药物或者制备纤维化通路调控试剂和药物中的应用；本发明通过CRISPR‑Cas9技术在C57BL/6J小鼠基础上的构建DSC2缺失突变型小鼠，DSC2敲除的小鼠能有效地诱导出右心室心肌病，可用于右心室心肌病研究的小鼠模型；单纯地敲除DSC2基因便可随着小鼠年龄的增长，小鼠自身出现右心室扩大，右心室心肌纤维化，以及中晚期右心室心力衰竭等右心室心肌病的表现，故该小鼠模型可以作为后续对右心室心肌病的分子机制研究中一种有效的模型。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种DSC2基因敲除小鼠模型的构建方法和应用。

背景技术

1905年Osler首次描述以右心室肌受累为主的疾病以来，先后报道了羊皮纸心脏、Uhls畸形、右室发育不良和心律失常源性右室发育不良。由于这些疾病均以右室心肌受累为主，病因和发生机制不清楚，1988年Thiene把它们统称为右心室心肌病(RVC)。

右心室心肌病临床表现差异较大，部分患者无任何临床表现，心脏也不扩大，仅在尸检或手术时才被发现，但绝大多数患者可出现心悸、易疲劳、胸闷、头晕及晕厥，甚至突发猝死。少数患者可发生右心衰竭，低血压休克，该类患者缺乏特异性体征，常有心界扩大，胸骨左下缘可闻及1-2级收缩期杂音，出现病理性第三、第四心音，第二音宽分裂及心动过速等，也无任何心脏体征。

超声心动图、心脏核素与心血管造影检查是确诊本病的可靠方法。主要改变为右室扩大，游离壁运动减弱或消失，室间隔与左室后壁同向运动，心尖部，膈面及漏斗部前壁可见憩室状或瘤样膨出，肌小梁消失。左室正常或被压后方而致心腔缩小，偶可见左室轻度增大，三尖瓣位置正常或伴反流。

根据病理尸检所见，病变可呈灶性或弥漫性，主要累及右心室前壁漏斗部(肺动脉圆锥)，心尖部及后下壁，三者构成了所谓的“发育不良三角”，右心室常呈球形增大，心腔扩张，可有室壁瘤形成，切面心室肌壁层不同程度变薄。镜下：以右心室心肌不同程度地被脂肪组织或纤维组织替代为特征，病变以右心室游离壁和心尖部较为明显，残存的心肌纤维萎缩，呈不规则索团状。部分病例可见灶性心肌坏死，炎症的反应及纤维化改变。

研究发现，右心室心肌病的心肌细胞坏死可能是一种由遗传决定的程序性细胞凋亡，持续性凋亡可导致心肌细胞进行性丧失而被纤维脂肪组织替代，这一学说很引人注意，因为它对典型的右心室受累做出了合理的解释。

桥粒是细胞间连接的主要方式，对维持上皮组织的正常形态和功能具有重要意义。桥粒胶蛋白(DSC)为钙粘蛋白超家族成员之一，与桥粒芯糖蛋白(DSG)合称为桥粒钙粘素(DC)，是组成桥粒的重要蛋白成分。人类桥粒钙黏素基因位于18号染色体长臂1区2带，表达DSC1-3与DSG1-4两组蛋白。与传统的钙黏素相似，DC具有完整的跨膜糖蛋白结构，其胞外部分包含氨基酸识别序列，以异二聚体的形式完成细胞间桥粒连接；而胞内区与胞浆内的附着板相连，进而连接细胞骨架的角蛋白成分。

DSC2蛋白是一种钙黏蛋白，属于跨膜蛋白，是桥粒的重要成分，在心肌、骨骼肌和消化道上皮中高表达，而桥粒是心肌细胞之间的重要连接，是闰盘的关键组成部分，桥粒不但可维持心肌组织结构和功能的完整性，增强心肌细胞承受机械应力时的黏附作用，还广泛参与到调控心肌细胞内外的信号转导途径。通过对DSC2蛋白晶体结构解析发现，DSC2可形成二聚体结构，早期桥粒的装配过程中，DSC2蛋白形成同源二聚体，而成熟桥粒的装配过程中DSC2蛋白和DSG2蛋白形成异源二聚体。其他桥粒相关蛋白(PKP2，DSP，DSG2和JUP)等突变已经证实和心肌病特别是ARVC等发病机制有关，主要是影响心肌细胞的桥粒以及闰盘结构从而引起心肌病变有关。既往已有报道相关桥粒蛋白(PKP2、DSP、DSG2和JUP)移码突变或无意突变造成的小鼠胚胎致死。