[发明专利]SEB标准物质的制备方法及测定SEB标准物质溶液浓度的方法

说明书

本发明公开了SEB标准物质的制备方法及测定SEB标准物质溶液浓度的方法。该测定SEB标准物质溶液浓度的方法利用T30和/或T7作为标准品制备标准曲线来测定SEB标准物质溶液的浓度，所述T30是氨基酸序列为序列表中序列1的多肽，所述T7是氨基酸序列为序列表中序列2的多肽。本发明所提供的SEB标准物质的制备方法，包括在培养基中培养金葡菌菌株S‑6，收集发酵产物，从发酵产物中纯化得到SEB蛋白，纯化得到的SEB蛋白即为SEB标准物质。本发明可用于日常检测的质量控制，将该标准物质用于不同试剂、不同检测方法检测下限的确定。

技术领域

本发明涉及SEB标准物质的制备方法及测定SEB标准物质溶液浓度的方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生的多种重要外毒素之一，具有典型的超抗原性质，不需要抗原提呈细胞(APC)处理而能够直接与MHCⅡ类分子结合(结合在MHCⅡ类分子抗原肽结合沟槽外侧)，导致带有特异性Vβ节段T细胞大量增殖的抗原分子。超抗原对T细胞的激活不受MHCⅡ类分子的限制，且对T淋巴细胞的激活能力是普通抗原的2,000-50,000倍，因此只需极低浓度(1-10pg/ml)即可激活多克隆T细胞产生很强的免疫应答。

肠毒素中SEB是美国已经公布装备的八种“标准”生物战剂之一，也是生物武器核查单上的失能性战剂。其分子量在23–29kDa，对热稳定，在室温下可保持1周以上，适合装备弹头，并通过生物战剂气溶胶形式释放；能抗多种蛋白酶降解，在pH4－10均有活性，中毒剂量低，在0.0004μg/kg的剂量下即可使受试者失能达2周时间，对人的致吐剂量仅为0.4μg/kg，少量吸入就可导致呕吐和腹泻，13小时内体温升至41℃以上，引起人体的多器官、多系统的损伤，造成机体免疫功能失调，临床表现为发热、低血压，严重的甚至引起致死性休克，具有很高的致残率。

由于SEB是食物中毒的主要原因，同时也是生物恐怖的潜在威胁，因此必须对监测水、食物的SEB污染发展出快速、敏感、特异的检测方法。建立检测方法必须有标准物质作为支撑，而建立SEB标准物质首先需要建立其定值方法。

发明内容

本发明提供测定SEB标准物质溶液浓度的方法，所述方法利用T30和/或T7作为标准品制备标准曲线来测定SEB标准物质溶液的浓度，所述T30是氨基酸序列为序列表中序列1所示的多肽，所述T7是氨基酸序列为序列表中序列2所示的多肽。

进一步地，上述利用T30和/或T7作为标准品制备标准曲线包括将所述T30作为溶质用50％乙腈水溶液作为溶剂配制T30标准品溶液的步骤和将所述T7作为溶质用50％乙腈水溶液作为溶剂配制T7标准品溶液的步骤。

进一步地，上述SEB标准物质溶液是以SEB标准物质为溶质，以SEB裂解液为溶剂配制而成的溶液。

所述SEB裂解液可为溶质为SDC(脱氧胆酸钠)、TCEP(三(2羧乙基)膦)、CAA(氯乙酰胺)、TEAB(三乙基碳酸氢铵)，溶剂为水的缓冲液。

进一步地，所述SEB裂解液中SDC的质量百分含量为0.1％，TCEP的浓度为10mM，CAA的浓度为40mM，TEAB的浓度为50mM。

进一步地，上述方法中所述利用T30和/或T7作为标准品制备标准曲线来测定SEB标准物质溶液的浓度包括将所述SEB标准物质溶液进行酶解得到酶解产物溶液的步骤，所述酶解产物含有所述T30和所述T7。

进一步地，所述酶解产物中含有的T30和T7摩尔浓度与SEB标准物质的摩尔浓度相同。

进一步地，所述SEB酶解产物制备可包括SEB裂解液的制备步骤；

进一步地，所述SEB酶解产物制备还可包括SEB裂解产物的变性步骤；