[发明专利]含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法

说明书

本发明公开了含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法，具体步骤如下：步骤一、Mo/Mmc基因组的提取：S1、Mo/Mmc贵州株的复苏与培养；S2、Mo/Mmc贵州株DNA的提取；步骤二、P113‑LppA‑IL‑2融合基因扩增：S1、粘膜免疫佐剂基因、绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种抗原基因扩增；S2、P113‑LppA融合基因扩增；S3、P113‑LppA‑IL‑2融合基因扩增；步骤三、含粘膜免疫佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的制备。本发明通过选择两个不同抗原基因和黏膜免疫佐剂基因研制出核酸疫苗，可有效针对羊支原体肺炎DNA疫苗免疫效果弱等问题，解决目前疫苗研发所面临的诸多问题。

技术领域

本发明涉及疫苗构建技术领域，具体涉及含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法。

背景技术

羊支原体肺炎是由丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp. Capri,Mmc)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)和山羊支原体山羊亚种(Mycoplasma capricolum subsp.Capricolum,Mcc)等支原体引起的在羊群中普遍流行的接触性传染病，纤维素性肺炎和胸膜炎是其主要特征，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传染病。近年来，我国多个养羊业发达的省区均有羊支原体肺炎的发生和流行的报道，疫病的流行严重影响着养羊业的健康发展，危害日趋加重，给全国养羊业造成巨大经济损失，且我国该病病原以绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种两种病原为主。免疫接种依然是防治该类传染病的重要措施之一，目前使用的疫苗为灭活疫苗，还存在一些不足：①灭活疫苗的免疫保护效力十分有限，且不能激发保护性细胞免疫应答；②羊支原体肺炎病原种类多样，目前的疫苗主要以Mmc生产，但Mo和Mmc之间无交叉免疫保护，灭活疫苗存在生产周期长，生产成本高等因素。因此，新型疫苗的开发显得十分迫切和必要。

羊肺炎支原体主要通过呼吸道等粘膜途径侵入山羊机体内，也可通过受伤的皮肤侵入，引起传染性胸膜肺炎、关节炎、乳腺炎以及结膜炎等表现。可见，阻止羊支原体从呼吸道粘膜侵入山羊机体内，诱发呼吸道等粘膜内相关淋巴组织的免疫应答应是羊肺炎支原体新型疫苗的研究关键或重点之一，而这正是粘膜免疫疫苗-DNA疫苗的优势所在。

相关研究资料认为，DNA疫苗抗原对黏膜免疫系统有效刺激是产生免疫效果的必要条件，而对黏膜免疫系统产生有效刺激需要两个条件，一是DNA 疫苗抗原能够有效投递到黏膜免疫系统；二是需要合适的黏膜佐剂。目前，已报道的粘膜免疫佐剂主要可分为三类：第一类是细菌性物质，包括蛋白(主要是细菌毒素)和核酸；第二类是各种细胞因子；第三类是抗原递送系统。而在 DNA疫苗研究过程中使用广泛的应数第一类中CpG ODN序列(CpG)、霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)，且免疫佐剂效果明显。本发明针对DNA疫苗免疫效果不尽理想问题，提出含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法。

发明内容

本发明的目的是提供含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法，通过选择两个不同抗原基因和黏膜免疫佐剂基因研制出核酸疫苗，可有效针对羊支原体肺炎DNA疫苗免疫效果弱等问题，解决目前疫苗研发所面临的诸多问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法，具体步骤如下：

步骤一、Mo/Mmc基因组的提取：

S1、Mo/Mmc贵州株的复苏与培养：

在超净工作台中使用酒精棉球擦拭保存Mo贵州株和Mmc贵州株的单管式冷冻管表面，用剪刀打开管口，加入改良Hayflick's培养基溶解冻干菌种，将溶液接种于5mLHayflick's培养基，37℃恒温震荡培养箱培养3～5d，当培养基颜色变为黄色时取200μL进行传代，连续传3代，并把每代培养物4℃保存备用；

S2、Mo/Mmc贵州株DNA的提取：