[发明专利]重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法

权利要求书

1.一种重组人纤连蛋白（rhFN），其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述制备方法具体包括以下步骤：

S1:表达；将重组质粒rhFN-pET28a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-rhFN；经卡那霉素抗性LB平板筛选的阳性转化子，接种至10mL卡那霉素抗性LB培养基中过夜培养；

S2：诱导；次日进行转接，培养至对数生长期加入诱导剂IPTG进行诱导发酵，20℃诱导16小时，离心收集菌体；

S3:鉴定；S2的诱导过程中对未诱导菌液、诱导完成的菌液分别取样1.5mL，4℃、12000×g、5min离心收集菌体，1.5mLPBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、12000×g、5min离心分离上清及沉淀，用1.5mLPBS复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各32μL，加入5×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况；

S4：纯化；使用AKTA纯化仪，连接Ni-NTA柱，采用分步洗脱的方法进行纯化，低温破碎菌体，离心收集上清，经亲和层析纯化得到重组人纤连蛋白；

S5：去除毒素；使用AKTA纯化仪，连接PMB柱除细菌内毒素。

3.根据权利要求2所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中的具体步骤如下：次日按照终OD为0.04转接到700mLLB/瓶培养基中培养至OD600达到0.6~0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导发酵，IPTG为诱导剂，20℃诱导16小时，4℃、大于等于3000×g、40min离心收集菌体，得到菌泥，菌泥获得量为3g/L。

4.根据权利要求2所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤S4中的具体步骤如下：

S41：菌泥进行重悬，重悬后使用超声破碎仪或高压均质仪破碎菌悬液；

S42：破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃、大于等于25000×g、30min，离心收集上清；

S43：离心后的菌液上清使用抽滤装置进行过滤，经过0.22μm滤膜过滤后作为蛋白原液进行后续试验；

S44：连接好AKTA和Ni-NTA柱，使用5-10倍柱体积的超纯水冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的50%-80%；

S45:待流穿液电导值接近0且紫外吸收值无明显变化后，使用5-8倍柱体积的A液平衡柱子，直至流穿液电导值和紫外吸收值均达到稳定不变为止，流速为柱料能承受的最大流速的30%-50%；

S46:平衡好柱子后开始上样，流速为柱料能承受的最大流速的10%-30%，若蛋白原液体积较小而浓度较高，应适当减少流速或增加重复上样次数，当流穿液的紫外吸收值开始变化时，收集上样流穿液并取样进行SDS-PAGE电泳；

S47：上样完毕后，继续使用A液进行平衡，直至流穿液电导值和紫外吸收值接近上样前数值且稳定后，停止平衡；平衡流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；

S48：柱子达到平衡后，采用分步洗脱的方式进行洗脱；第一步使用2%B和98%A进行洗脱，洗脱时流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳；

S49：当步骤S48中第一步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用5%B和95%A进行第二步洗脱，洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%，在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳；

S410：当步骤S49中第二步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用30%B和70%A进行第三步洗脱，洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%，在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳；S411：当步骤S410中第三步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用100%B进行柱冲洗，洗去仍未洗下的蛋白；洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；

S412：使用ClinXImageAnalysis对SDS-PAGE电泳结果进行灰度分析，计算蛋白纯度；

S413：纯化后蛋白使用紫外分光光度计进行浓度测定；

S414：纯化后的蛋白使用PALL30KD超滤管进行浓缩换液；离心程序为4℃，3800×g，4min，更换缓冲液为PBS，pH7.4；浓缩后蛋白再次使用紫外分光光度计进行浓度测定；

S415：浓缩后的蛋白取一部分进行稳定性试验，均分为两份，一份添加2%~5%终浓度的海藻糖和甘露醇，一份不添加任何保护剂，0.22μm滤器过滤除菌后放置于4℃冰箱过夜保存，第二天进行浓度测定。