[发明专利]一种用于快速高效诱导表达外源蛋白的大肠杆菌工程菌及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于快速高效诱导表达外源蛋白的大肠杆菌工程菌及其制备方法与应用。本发明将大肠杆菌菌株B834的阿拉伯糖操纵子araBAD编码区敲除，构建出E.coli B834(ΔaraBAD)菌株，从而成功将阿拉伯糖诱导原核表达系统成功应用于E.coli B834(ΔaraBAD)菌株，形成一套新的快速高效诱导表达外源蛋白稳定表达的大肠杆菌表达系统。pBAD载体能够应用于本发明菌株E.coli B834(ΔaraBAD)，且目的蛋白可得到高水平稳定表达。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于快速高效诱导表达外源蛋白的大肠杆菌工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

大肠杆菌工程菌是生产外源蛋白使用最广泛的原核表达宿主之一，其遗传学特征远优于其他微生物。近年来，随着大肠杆菌在转录、翻译和蛋白折叠方面的基础性研究取得长足进步，以及陆续发现的和改进的遗传学工具的使用，都使得大肠杆菌原核表达系统在表达复杂的真核蛋白方面显示出了比以往更加强大的生命力。与其他外源蛋白表达系统相比，大肠杆菌原核表达系统具有以下明显优势：1.遗传背景清楚，经全基因组测序发现共有4405个开放性读码框；2.与之配套的外源蛋白表达系统成熟完善，可满足不同的需求，目前应用最广泛的大肠杆菌蛋白表达系统有pET、pBAD、pGEX等；3.培养操作简单、生长周期短、成本低、表达水平高、遗传稳定等。4.经美国FDA批准的安全基因工程宿主菌。在宿主菌的使用过程中，人们常常会根据实际的应用需要，对宿主菌进行修饰改造，以改变菌株的某些特性，从而获得更好的表达效果。

大肠杆菌菌株B834具有以下特性：1.不包含F因子(F-)；2.蛋白水解酶Ion和OmpT外膜蛋白水解酶基因缺陷型，有利于外源蛋白的稳定表达；3.缺失gal基因，故无法直接利用半乳糖作为碳源；4.不表达T7RNA聚合酶，因此不适合于启动子为T7的蛋白质表达系统，如pET系列；6.hsdR和hsdM缺陷型，hsdR表达产物为I型限制性酶EcoK(K12菌株)，该基因缺失有利于外源DNA的导入，hsdM表达产物为I型限制性DNA甲基化酶复合体，该基因缺失使菌株内的DNA不被dcm甲基化。pBAD载体系统是一种在大肠杆菌中实现重组蛋白的可靠且可控表达的系统，该系统通过araBAD操纵子控制大肠杆菌L-阿拉伯糖的代谢。该系统将目的基因置于pBAD载体中araBAD启动子的下游，然后转化到TOP10(基因型为F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)80lacZΔM15ΔlacX74 nupG recA1 araD139Δ(ara-leu)7697 galE15galK16 rpsL(StrR)endA1λ-)菌株中，由于该菌株基因组不包含araBAD操纵子，因此可与pBAD载体配套形成一套可控的诱导表达系统。AraC是一种转录调节因子，与L-阿拉伯糖形成复合物。当L-阿拉伯糖存在时，araBAD启动子驱动目的基因的高效表达；当葡萄糖存在时，目的基因的表达则被抑制。该载体系统可精确控制目的基因的表达，特别适用于生产困难蛋白，如具有毒性或不溶性蛋白。与pET表达系统相比，pBAD表达系统具有以下优势：1.诱导表达更加严谨：在缺少L-阿拉伯糖的情况下，外源蛋白的本底表达水平极低，并可通过葡萄糖进一步抑制；2.诱导灵敏度高：在去除葡萄糖并加入L-阿拉伯糖的情况下，外源蛋白的表达水平可飙升至1000倍以上。3.诱导成本低：L-阿拉伯糖价格低廉，有利于大规模表达外源蛋白；4.操作相对简便：克隆与表达宿主菌均为TOP10，故不需要提取质粒后，重新转化表达菌株这一步骤。

然而，pBAD表达载体原本配套使用的TOP10菌株亦有其不足之处，由于宿主菌TOP10并未删除蛋白水解酶Ion和OmpT外膜蛋白水解酶基因，Ion和OmpT基因产物会造成外源蛋白的水解，往往会在细胞内对外源蛋白产生降解作用，不利于外源蛋白的稳定表达。而大肠杆菌菌株B834基因组虽然不包含Ion和OmpT基因，但是大肠杆菌菌株B834具有其明显的缺陷：由于该菌株基因组中保留了完整的阿拉伯糖操纵子，可对体系中加入的L-阿拉伯糖进行代谢，因此pBAD这类利用L-阿拉伯糖作为诱导剂的蛋白表达系统无法利用该菌株作为宿主菌来进行长期的诱导(5小时)。

发明内容