[发明专利]一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法。引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物。检测方法为：(1)提取大熊猫血液DNA，备用；(2)以步骤(1)所得DNA为模板，采用外引物对进行第一轮PCR；(3)以第一轮PCR产物为模板，采用内引物对进行第二轮PCR，然后凝胶电泳并判断是否含有巴贝斯虫。本发明针对大熊猫源巴贝斯虫的18S rRNA为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了缺乏针对大熊猫源巴贝斯虫的分子检测方法，实现对大熊猫巴贝斯虫特异且灵敏的早期诊断方法。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法。

背景技术

巴贝斯虫（Babesia）是寄生于脊椎动物红细胞内的顶复门原虫，蜱是主要的传播媒介，红细胞是唯一可感染的宿主细胞。由巴贝斯虫感染引起的巴贝斯虫病，是世界范围性血液原虫病，其主要临床症状为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等。目前已经有100种以上的巴贝斯虫得到鉴定。该病不仅给畜牧业和国民经济造成巨大损失，同时也严重危害了野生动物健康与种群保护，可危害犬科、猫科、浣熊科、鹿科和灵长类等动物，个别种类还有人感染的报告。大熊猫源巴贝斯虫（GenBank: MT256300.1）是在大熊猫血液中发现的一种巴贝斯虫，是首次报告大熊猫感染巴贝斯虫并引起巴贝斯虫病，该巴贝斯虫从亲缘关系树的分析，显著区别于牛巴贝斯虫、犬巴贝斯虫和田鼠巴贝斯虫等中国主要流行的巴贝斯虫病原，其引物并不适用于大熊猫源巴贝斯虫的检测。因此，缺乏针对大熊猫源巴贝斯虫的特异性引物，显著影响大熊猫源巴贝斯虫检出率，目前，急需探索一种用于检测大熊猫源巴贝斯虫的特异性引物和检测方法。

针对该病，最基础的检测方法为血液涂片显微镜镜检法，该方法检出率低，也无法辨别虫种，无法做到早期诊断，目前用作急性发病期的辅助检测手段；临床上常使用血清学检测进行巴贝斯虫流行病学研究，但由于市面上没有针对大熊猫的抗体，在检测中使用的抗体存在较大的种属差异性，不能准确的反应出大熊猫感染巴贝斯虫血清学检测的结果；因此在实验室诊断中，最常使用的是分子诊断技术，其中最常用的为普通PCR检测技术，但该方法检测大熊猫巴贝斯虫时会出现低灵敏性的问题，大熊猫带虫量低时会出现漏检等问题，不利于大熊猫源巴贝斯虫的早期诊断。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法，本发明针对大熊猫源巴贝斯虫的18S rRNA为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，提供了一种针对大熊猫源巴贝斯虫的套式PCR检测方法，解决了缺乏针对大熊猫源巴贝斯虫的分子检测方法，实现对大熊猫巴贝斯虫特异且灵敏的早期诊断方法。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物，包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物。

一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的试剂盒，包括上述引物、PCR反应预混液、阳性对照以及阴性对照。

进一步地，PCR反应预混液包括Taq酶、dTNP、Mg²⁺离子、缓冲液等成分。

进一步地，阴性对照为ddH₂O。

进一步地，阳性质粒中含有大熊猫源巴贝斯虫18S rRNA基因。

进一步地，阳性质粒的构建方法为：