[发明专利]一种复合生物保鲜剂及其制备方法、使用方法和应用

权利要求书

1.一种复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：由枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的菌液或菌粉复配而成；所述枯草芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO: M2021642的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005；所述贝莱斯芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO:M2020672的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBL-B12005和所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的复配比例为1：1，以活菌数来计；

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)K-19分别发酵得到发酵液，干燥发酵液获得菌粉，将上述菌株的菌粉或发酵液与其他辅料进行复配得到；

将该保鲜剂制成可湿性粉剂，包括以下步骤：

(1)选取菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19；

(2)菌株的活化：将步骤(1)选取的菌种冻干、分别接种于固体LB斜面培养基上，并于30℃-37℃恒温培养箱中培养24h-30h；

(3)制备种子液：将培养好的斜面取一环接种于50ml-100ml的种子液培养基中，在30℃-37℃条件下，180rpm震荡培养18-24h，制得一级种子液；

(4)扩大培养：以1％(V/V)的接种量，将一级种子液接于500ml-1000ml种子液培养基中，在37℃条件下，震荡培养12-14h，制得二级种子液；

(5)发酵罐培养：以1％(V/V)的接种量，将二级种子液接种于液体发酵培养基中，于30-37℃条件下，通气培养24-34h；

(6)收集发酵产物：发酵罐中芽孢率达到90％以上时，收集发酵液；

(7)发酵结束后，枯草芽孢杆菌发酵液添加0.5-1％轻质碳酸钙，立即喷雾干燥，即分别得到枯草芽孢杆菌菌粉和贝莱斯芽孢杆菌菌粉；

(8)复配：将步骤(7)所得枯草芽孢杆菌菌粉和贝莱斯芽孢杆菌菌粉按照1：1复配，以活菌数来计；即得。

2.根据权利要求1所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)和步骤(4)种子液培养基为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、其余为水，pH7.0。

3.根据权利要求1所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：步骤(5)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的液体发酵培养基为：甜菜糖蜜3.0％，K₂HPO₄ ×3H₂0 0.7％，(NH₄) ₂SO₄ 0.15％，磷酸二氢钠0.8％，碳酸钙0.2％，MgSO₄ ×7H₂0 0.01-0.06％，硫酸锰0.03％，其余为水，pH为7.0-7.2；

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的液体发酵培养基为：豆粕40g/L、葡萄糖9g/L、MgSO₄ 0.1g/L、MnSO₄ 2.5mg/L、FeSO₄ 0.8mg/L，其余为水，初始pH6.8。

4.一种如权利要求1所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：将该保鲜剂制成液体菌剂，包括以下步骤：

(1)先分别制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的发酵液，并用无菌水配制成1×10⁹CFU/ml的发酵液；

(2)将步骤(1)所得发酵液按1：1进行复配混合，然后加入0.5％山梨酸钾、4％氯化钠混合均匀，添加0.4％-1.0％的柠檬酸调节pH至4.5，即得。

5.根据权利要求4所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：该液体菌剂的活菌数≥10亿CFU/ml。