[发明专利]热稳定性提高的玉米赤霉烯酮内酯水解酶的突变体S162P及其应用

说明书

本发明公开了热稳定性提高的玉米赤霉烯酮内酯水解酶的突变体S162P及其应用，属于酶工程技术领域。本发明将来源于微生物GliocladiumroseumMA918的玉米赤霉烯酮内酯水解酶酶作为亲本，利用基因突变技术，将162位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)，获得单点突变体S162P。与野生酶相比，在原始催化活力未发生明显变化的基础上，突变体酶的热稳定性显著提升：突变体酶在50℃保温2min后残余酶活提高为野生酶的1.52倍；在48℃分别保温10min和20min后，仍具有约80％和58％的残余酶活，在48℃的半衰期也提高为野生酶的3.6倍。为实现ZEN内酯水解酶的工业化应用打下了一定的基础。

技术领域

本发明涉及热稳定性提高的玉米赤霉烯酮内酯水解酶的突变体S162P及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一种非甾体类雌激素的霉菌毒素，化学名称为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯。1962年，ZEN首次在发霉的玉米中被发现，是一种镰刀菌属产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于发霉的玉米、小麦、大麦以及其他的谷物和谷物副产物中，已经成为一种世界范围内的食品和饲料污染物。通常，不合适的储藏条件(10-30℃的温度和40-50％的环境相对湿度)是造成ZEN产生的主要原因。此外，ZEN还具有多种有毒的衍生物如：α/β-玉米赤霉烯醇(α/β-Zearalenol，α/β-ZOL)，α/β-玉米赤霉醇(α/β-Zearalanol，α/β-ZAL)，玉米烯酮(Zearalanone，ZAN)等。作为一种外源的雌激素类似物，ZEN及其衍生物可以竞争性的与雌激素受体结合，对人类和很多养殖动物造成生殖毒性，基因毒性，免疫毒性和致癌性，对人类和牲畜的健康造成极大的危害，也给粮食工业、食品工业、饲料工业和畜牧业造成巨大的经济损失。

近年来，ZEN在粮食，食品和饲料中的污染程度有增无减，生物毒素的有效脱毒也被科技部列为2019国家重点研发计划之一，因而探索有效且环保的ZEN脱除方法越来越受到人们的关注。目前ZEN脱除方法主要可分为物理脱除，化学分解和生物降解三种。其中物理脱除是利用加热，辐照或吸附等方法去除ZEN，但往往会破坏营养成分并且脱除效率较低；化学分解则是采用酸/碱水解，氨化或者臭氧化等方式对ZEN脱毒，脱除效率不高并且会造成二次污染，不利于环保和动植物健康。生物降解法是利用微生物菌体对ZEN的吸附作用或微生物产生的酶对ZEN的降解作用，具有专一性好，作用条件温和，脱毒效率高，不破坏营养物质和不产生二次污染等优势，是目前研究的热点方向。

目前，ZEN的降解酶主要包括漆酶(Laccase)，过氧化物酶(Peroxidase)和内酯水解酶(Lactonase)三种。其中，漆酶主要用于降解黄曲霉毒素，用于降解ZEN时需要氧化还原介质(丁酸甲酯)的存在；过氧化物酶降解ZEN的机制尚不明确；内酯水解酶是目前最受关注的ZEN降解酶。在酶学研究中内酯水解酶可以催化ZEN的内酯环打开，并自发脱羧，形成一个完全无毒的降解产物。

2002年Naoko首次在粉红粘帚菌Clonostachysrosea IFO 7063中发现了一种具有降解ZEN能力的内酯水解酶，并将其命名为ZHD101。随后多种不同来源的可降解ZEN的内酯水解酶，如：来自Gliocladiumroseum的ZEN-jjm，来的Gliocladiumroseum 31535的Zhly-6，来自Cladophialophorabatiana的Cbzhd，来自Rhinocladiellamackenziei CBS 650.93的Zhd518以及来自Neurospora crassa的ZENC相继被发现。其中，ZHD101已经在E.coli BL21，P.pastoris GS115以及S.cerevisiae等多种宿主里成功表达，是目前研究最深入的一种ZEN内酯水解酶。

目前，对ZEN内酯水解酶的研究集中在酶学性质鉴定以及底物特异性的改造。而作为一种饲用酶，不仅要有较高的活性和广泛的底物特异性，更需要具有高热稳定性以耐受造粒工艺的高温，来适应实际的工业生产。

发明内容