[发明专利]用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法

权利要求书

1.用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条，包括PVC底板，其特征在于：还包括依次粘贴在PVC底板上的吸水垫、硝酸纤维素膜、标记垫和样品垫；

所述样品垫设置在所述PVC底板的一端上；所述样品垫设有样品滴入区；所述样品垫的一端搭设在所述标记垫上，所述标记垫上喷有CanineCV抗体-胶体金复合物，远离所述样品垫的所述标记垫一端搭设在硝酸纤维素膜上；所述硝酸纤维素膜固定连接在PVC底板上，所述硝酸纤维素膜上包被有质控线C、检测线T，所述质控线C与检测线T相互平行，并垂直于试纸条延长方向设置；所述质控线C包被有CanineCV重组抗原；所述检测线T包被有CanineCV抗体；远离所述样品垫的所述硝酸纤维素膜一端搭设在吸水纸下。

2.根据权利要求1所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条，其特性在于：所述标记垫上的CanineCV抗体-胶体金复合物喷量为2～4μl/cm，胶体金标记CanineCV抗体的比例为每毫升标记量为5～10μg，CanineCV抗体-胶体金复合物浓缩倍数为20～30倍，即每20～30ml胶体金浓缩至1ml，喷量为2～4μl/cm。

3.根据权利要求1所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条，其特性在于：所述硝酸纤维素膜上的检测线T包被的CanineCV抗体的浓度为0.5～1.0mg/ml，划线量为1.0～2.0μl/cm；所述的质控线C包被的CanineCV抗原的浓度为1.0～2.0mg/ml，划线量为1.0～2.0μl/cm。

4.根据权利要求1所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条，其特性在于：所述胶体金粒径为20-50nm。

5.权利要求1-4任一项所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法，其特性在于：包括下列步骤：

(1)胶体金溶液的制备；

(2)标记垫的制备，包括CanineCV抗体-胶体金复合物的制备，取1ml的胶体金溶液，加入2～10μl的0.1mol/l K₂CO³溶液混匀，加入5～10μg CanineCV抗体混匀15min，再加入50～100μl的10％BSA溶液进行封闭10min，置于冷冻离心机内4℃，10000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用胶体金复溶液复溶至30～50μl，2～8℃储存备用；

(3)包被质控线C、检测线T；

(4)样品垫的预处理；

(5)切割与组装；得到成品。

6.根据权利要求5所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法，其特性在于：所述的胶体金复溶液含有pH8.2的0.02mol/l Tris缓冲液、0.1％Casein、0.3％～0.5％PVP40、2～5％海藻糖混合液。

7.根据权利要求5所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法，其特性在于：所述步骤(1)中的制备过程包括，称取100ml超纯水至锥形瓶内，加入1.0ml 1％氯金酸溶液至锥形瓶中混匀，加热至沸腾时，迅速加入适量1％柠檬酸三钠，观察溶液颜色变化，待颜色稳定不变后，继续加热5分钟，然后停止加液，将溶液冷却至室温后，置于2～8℃保存。

8.根据权利要求5所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法，其特性在于：所述步骤(2)还包括S2、喷金，使用三维喷金划膜仪将CanineCV抗体-胶体金复合物喷至标记垫上，喷量为2～4μl/cm；将喷好的标记垫置于干燥室(湿度＜30％)干燥12h后，加入干燥剂封口备用。

9.根据权利要求5所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法，其特性在于：所述步骤(4)的处理过程包括，将样品垫用样品垫预处理液浸泡30min，沥干后置于干燥室(湿度＜30％)干燥12h后，加入干燥剂封口备用；

所述样品垫预处理液含有pH 7-9，Tris-Hcl缓冲液、0.5％吐温20、0.5％海藻糖的混合液。

10.根据权利要求5所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法，其特性在于：所述步骤(3)的具体步骤包括，S1、质控线C、检测线T包被液的制备：取CanineCV，用pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液稀释成1.0～2.0mg/ml的质控线C溶液；取CanineCV抗体，用pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液稀释成0.5～1.0mg/ml的检测线T溶液；

S1、划膜：使用三维喷金划膜仪将质控线C、检测线T包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室(湿度＜30％)干燥12h后，加入干燥剂封口备用；

所述步骤(5)的过程包括，取吸水垫、已处理的样品垫和金标垫，按照(15-20mm)*300mm尺寸进行切割，切割好后的吸水垫、样品垫、金标垫分别加入干燥剂封口备用；

取已切割好的吸水垫、样品垫、金标垫和划过膜的PVC底板，贴上金标垫，使金标垫压在硝酸纤维素膜1～2mm，再贴上样品垫，是样品垫部分压在金标垫3～5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压在硝酸纤维素膜1～2mm；组装好的PVC底板切割成3～4mm的用于检测CanineCV抗原的胶体金免疫层析试剂条，得到成品。