[发明专利]一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种提高二氢青蒿酸/青蒿酸比例的酿酒酵母工程菌，其特征在于，通过二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的酿酒酵母底盘菌株，其原有表达ALDH1的序列为表达突变的ALDH1^V247F的序列；其中，原有ALDH1的序列为GI号为422034338的蛋白序列，ALDH1^V247F即ALDH1第247位的缬氨酸突变为苯丙氨酸。

2.根据权利要求1所述酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母底盘菌株为市售CEN.PK2系酿酒酵母。

3.根据权利要求1所述酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述表达突变的ALDH1^V247F的序列为表达ALDH1^V247F的序列或表达DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白的序列。

4.根据权利要求1-3任意一项所述酿酒酵母工程菌，其特征在于，还包括，原有表达DBR2的序列为表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列。

5.权利要求1-4任意一项所述酿酒酵母工程菌在生产二氢青蒿酸或以二氢青蒿酸为中间产物的产品中的应用。

6.ALDH1^V247F及其编码序列在构建生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌中的应用。

7.DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白及其编码序列在构建生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌中的应用。

8.权利要求1所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、以根据二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的底盘菌株作为出发菌株，所述底盘菌株通过基因整合和/或质粒导入的方式至少将ADS、CYP71AV1、CPR1、CYB5、 ADH1、DBR2和ALDH1的编码序列转入；

步骤2、若原有表达ALDH1的序列预通过质粒导入的方式转入底盘菌株，则利用质粒上原有表达ALDH1的序列的两端酶切位点，对表达突变的ALDH1^V247F的序列进行处理，通过酶切方式替换掉原有表达ALDH1的序列，然后再将质粒转入底盘菌株；

若原有表达ALDH1的序列是通过基因整合方式转入底盘菌株，则利用原有表达ALDH1的序列的上、下游序列合成上、下游同源臂，通过OE-PCR和质粒酶切方式将上、下游同源臂与表达突变的ALDH1^V247F的序列连接起来，获得上游同源臂+表达ALDH1^V247F的序列+下游同源臂的片段，通过电转化方式将该片段转入到酿酒酵母中，通过酿酒酵母同源重组机制，利用同源臂替换掉原有表达ALDH1的序列。

9.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述ADS、CYP71AV1、DBR2的编码序列通过质粒导入的方式转入底盘菌株中，所述CPR1、CYB5、 ADH1和ALDH1通过基因整合的方式转入底盘菌株中。

10.根据权利要求8或9所述构建方法，其特征在于，还包括：

合成表达DBR2和ADH1的融合蛋白的序列并替换原有表达DBR2的序列。