[发明专利]一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法

权利要求书

1.一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：构建重组表达载体；

S11：根据NCBI基因库中启动子p7.5、启动子p11和TK基因序列构建质粒：选取以TK基因为中心的3000bp基因序列，设计引物，将TK基因分为两段进行PCR扩增，扩增后每段长度分别为1500bp，得到TKF，TKR基因片段，并分别进行双酶切；其中酶切位点为MfeⅠ，SacⅠ以及AscⅠ，XmaⅠ；

S12：根据原始质粒全基因序列设计引物，将原始质粒的PTKF基因进行PCR扩增，将扩增后的产物进行双酶切，与所述TKR基因片段根据酶切位点进行链接后转至大肠杆菌TOP10克隆菌株培养，得到PTKF-TKR质粒；

S13：根据PTKF-TKR质粒全基因序列设计引物，将PTKR基因进行PCR扩增，将扩增后的产物进行双酶切，与所述TKF基因片段根据酶切位点进行链接后转至大肠杆菌TOP10克隆菌株培养，之后进行表达载体构建得到PTKF-TK-PTKR质粒；

S2：重组转移质粒的构建；

通过MSPB与NADH两端基因序列，设计两对引物，进行PCR扩增反应，将PCR反应产物与PTKF-TK-PTKR质粒分别进行双酶切，将酶切后的MSPB与NADH两段外源基因分别与质粒PTKF-TK-PTKR酶联，得到重组质粒PTKF-TK-PTKR-M以及PTKF-TK-PTKR-N；

S3：重组病毒的转染与纯化；

S31：通过PureYieldTM Plasmid Maxiprep System试剂盒，提取所述重组质粒，并且在提取过程中，去除质粒内毒素；

S32：按照Lipofectamine PlusTM Reagent试剂盒将去除毒素的质粒与病毒株在细胞中进行转染，经过多轮噬斑筛选获得纯的表达绿色荧光的噬斑进行纯化后得到两株重组病毒rFPV/MS-MSPB以及rFPV/MS-NADH。

2.根据权利要求1所述的一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法，其特征在于，所述S11步骤中引物序列如下：

TKF-f：ATCCAATTG TCACACGAATGTTTTATATTACAAG

TKF-r：CGCGAACTC GAATTGAGCCTCGTCTATACC

TKR-f：TTGGCGCGCCTTTCTAGACATAGTAGAATTTAGTGAATCCATG

TKR-r：AATCCCGGGTTCATCTGTTTCTTTTATTTTGTAACCACCT。

3.根据权利要求2所述的一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法，其特征在于，所述TKF基因的酶切反应体系为2×Phanta Max Master Mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，TKF基因2μL，dd H₂O补至50μL；PCR反应条件为95℃预变性2.5min，95℃变性15s，61.4℃退火15s，并在72℃延伸60s，进行32个循环后在72℃彻底延伸5min。

4.根据权利要求2所述的一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法，其特征在于，所述TKR基因的酶切反应体系为2×Phanta Max Master Mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，TKR基因2μL，dd H₂O补至50μL；PCR反应条件为95℃预变性2.5min，95℃变性15s，55.7℃退火15s，并在72℃延伸60s，进行32个循环后在72℃彻底延伸5min。

5.根据权利要求1所述的一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法，其特征在于，所述S12步骤中引物序列如下：

PTKF-F：ATTCCCGGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACA

PTKF-R：AATGGCGCGCCTCCGGAACTAGTCCTGCAGG。