[发明专利]一种凝结芽孢杆菌的计数检测方法

说明书

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌的计数检测方法，包含以下步骤：(S1)以无菌操作进行待测样品的如下操作：稀释、热激活、超声分散、均质后得到样品稀释液；(S2)对样品稀释液进行连续梯度稀释，直至样品稀释液预估含菌量为10‑300CFU/mL后结束稀释；(S3)取适宜稀释梯度的样品在pH在5.0‑5.5的BC培养基中培养后，进行凝结芽孢杆菌菌落计数。此方法可广泛适用于不同凝结芽孢杆菌菌株的检测，并且计数结果准确、平均误差小、检测周期仅需26‑30小时即可得出结果。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及凝结芽孢杆菌菌液或菌粉中凝结芽孢杆菌营养体和芽孢的检测方法。

背景技术

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是目前全球范围内获得各国政府在食品、饲料中添加许可的唯一一种芽孢乳酸菌。其主要有益生功能是在肠道代谢过程中产乳酸，对促进消化吸收，维持肠道菌群平衡有着非常重要的功效。同时，因为其芽孢具有耐高温、耐酸碱、耐胆盐等优良的抗逆性能，大大拓展了益生菌在食品行业中的应用范围，近年来凝结芽孢杆菌被众多食品、饲料企业所关注，并已有不少添加凝结芽孢杆菌产品上市销售。

由于凝结芽孢杆菌相较于其他传统益生菌而言，被研究和应用的时间较短，国家标准中还没有发布其统一的检测方法，各单位的检测方法往往只适用于自身研究的菌株。细菌计数检测是一项系统性的工作，凝结芽孢杆菌在代谢过程中分泌的多糖和糖蛋白会导致菌体之间出现强粘结状态，一般的处理方式难以使其分散。所以凝结芽孢杆菌计数检测时的预处理方式、分散方式、培养基组分、培养条件中的任何一步都有可能使计数结果出现不准确、平均误差过高等情况。

专利CN202010644874.6公开了一种凝结芽孢杆菌菌粉芽孢的检测方法，涉及微生物检测技术领域，包括如下步骤：(1)将待测的凝结芽孢杆菌菌粉样品加入到含有吐温80的带玻璃珠的无菌生理盐水中，于恒温震荡器上均质，制成样品匀液；(2)汲取均质后的所述样品匀液进行水浴加热，加热完成后取出冷却至室温得到样品待测液；(3)将所述样品待测液进行10倍梯度稀释，取适宜稀释梯度的样品待测液进行培养，观察，检测。该专利通过对样品均质稀释用的生理盐水添加一定浓度的吐温80进行改良试验，在不影响样品生长活性条件下，起到了有效的分散样品菌粉芽孢的作用。但该专利有以下不足：(1)将水浴加热置于均质之后，极易造成已经分散的细菌在静置加热的环境下沉降后重新结团，导致计数结果出现偏差。(2)采用含有吐温80的生理盐水在三角瓶中震荡分散菌粉，适用于分散低粘结度的细菌，无法彻底解决强粘结状态下细菌分散度的问题。(3)众所周知，细菌的生长需要合适的培养基组分和培养条件，该专利未提供广泛适用于各凝结芽孢杆菌菌株的培养基组分和培养条件，适用范围窄。(4)该专利需要培养48±2h后计算结果，检测周期长，不利于实际生产。故而针对上述问题，我们需要找到一种可以做到结果误差小，同时能够广泛适用于不同凝结芽孢杆菌菌株检测的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，以适用凝结芽孢杆菌菌株范围广、计数结果准确、平均误差小、检测周期短为目标，对稀释液配方、培养基配方、培养条件、强粘结状态细菌的分散方式进行研究，提供了一种凝结芽孢杆菌的计数检测方法。此方法可广泛适用于不同凝结芽孢杆菌菌株的检测，并且计数结果准确、平均误差小、检测周期仅需26-30小时即可得出结果。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

一种凝结芽孢杆菌的计数检测方法，包括以下步骤：

(S1)以无菌操作进行待测样品的如下操作：稀释、热激活、超声分散、均质后得到样品稀释液；

(S2)对样品稀释液进行连续梯度稀释，直至样品稀释液预估含菌量为10-300CFU/mL后结束稀释；

(S3)取适宜稀释梯度的样品在pH在5.0-5.5的BC培养基中培养后，进行凝结芽孢杆菌菌落计数。

进一步地，步骤(S1)中，所述待测样品为凝结芽孢杆菌菌粉或凝结芽孢杆菌菌液。