[发明专利]一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法

说明书

本发明属于生物工程的技术领域，具体涉及一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法。所述的转染试剂为一种两亲性聚合物，其为以疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的聚乙烯亚胺衍生。本发明所提供的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，通过疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的得到，原料成本低廉，制备方法简单。本发明所提供的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染方法，省去了在细胞内进行病毒包装、筛选的步骤，简化了原有的实验流程，提高了工作效率，节约了经济成本，为昆虫杆状病毒表达载体在柞蚕体内进行蛋白表达的研究奠定了基础，也为杆状病毒在昆虫中的应用指明了一条新的方向。

技术领域

本发明属于生物工程的技术领域，具体涉及一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法。

背景技术

杆状病毒(Baculovirus)由壳、内核和壳外包膜结构组成，形态为杆状。杆状病毒主要是鳞翅目昆虫的病原体，同时也感染膜翅目，双翅目，鞘翅目和毛鳞翅目等节肢动物。杆状病毒根据形态和结构被分为三个属：核型多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus，NPVs)，颗粒性病毒(Granulosis Virus，GVs)，非封闭杆状病毒(NonoccludedBaculoviruses，NOBs)。野生核型多角体病毒被29kDa多角体蛋白包被，形成多角体结构。多角体非常稳定，能长久保存在植物表面和土壤中。但受到鳞翅目昆虫中肠的高pH10影响时，会溶解并释放出感染性病毒粒子，从而感染宿主。核型多角体病毒由于容易获得，因此得到广泛研究和应用。

核型多角体病毒(NPV)在感染晚期大量表达多角体蛋白，杆状病毒表达载体系统利用这一特征，通过强多角体蛋白启动子来驱动外源基因的表达。随着基因工程技术的发展，核型多角体病毒表达载体系统的构建越来越完善，目前已和酵母、大肠杆菌和哺乳动物并称为四大表达系统。

柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pemyi NuclearpolyhedrosisVirus，ApNPV)是危害柞蚕的主要病原体之一，具有高度的特异性。随着基因工程的发展，柞蚕核型多角体表达系统日益完善，利用该系统已成功表达绿色荧光蛋白和人生长激素等多种蛋白。柞蚕蛹作为表达蛋白的宿主，个体大，具有滞育的特性，使其更易于长期保存。Bac-to-Bac技术的产生极大提高了构建柞蚕核型多角体重组病毒的效率，缩短了表达外源蛋白周期，对工业化生产有很大意义。

目前在利用ApNPV于柞蚕蛹体内进行蛋白表达的过程中，需要经过基因克隆、构建载体、细胞转染、重组病毒包装与筛选、外源蛋白表达等步骤。其中细胞转染、重组病毒包装与筛选不仅是此过程的重点，也是难点。原因主要有：

1、由于柞蚕核型多角体病毒的寄主专一性，目前还没有发现对该病毒特别敏感的细胞用来进行转染、形成病毒包装等实验。

2、转染实践中，昆虫细胞培养条件非常复杂、成本也特别昂贵。

3、目前的Tn5细胞虽然能够被柞蚕核型多角体病毒感染，但转染效率普遍较低，操作也特别复杂，且重组病毒感染柞蚕时病毒活性较低。

综上，如何解决在柞蚕蛹体内进行蛋白表达过程中获得重组病毒是本领域急需解决的问题。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法。该方法通过以疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰所得到的两亲性共聚物为转染试剂，将柞蚕核型多角体重组病毒杆粒DNA与转染试剂混合，直接注入柞蚕蛹体内进行体内转染获得重组杆状病毒，进而表达外源蛋白，从而跳过转染细胞进行病毒包装这个步骤。该方法不仅解决了细胞转染过程中的难点，同时简化了实验流程，提高了工作效率，节约了经济成本，为昆虫杆状病毒表达载体在柞蚕体内进行蛋白表达的研究奠定了基础。

第一方面，本发明提供一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，所述的转染试剂为一种两亲性聚合物，其为以疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的聚乙烯亚胺衍生物，结构如下式I所示：