[发明专利]基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒，通过核酸互补杂交，目标miRNA特异性地打开发卡探针，发生催化发卡自组装反应，生成大量双链DNA产物，双链产物继续引发杂交链式反应，形成含有多个G‑四链体的DNA纳米线，G‑四链体与氯化血红素结合形成具有类辣根过氧化物酶催化活性的G‑四链体/氯化血红素DNAzyme。在过氧化氢的存在下，DNAzyme催化鲁米诺的氧化反应，产生多级扩增的化学发光信号。本发明试剂盒可以检测低至16 pM的miRNA；该检测方法无需荧光基团修饰、外部光源和蛋白酶介入，通过多级扩增反应即可有效提高miRNA检测的灵敏度，从而解决了现有检测方法由于自发荧光、荧光漂白、串光以及稳定性低导致的灵敏度有限的难题。

技术领域

本发明属于分子生物学和医学检测领域，具体涉及到一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，在细胞内具有多种重要的调节作用，其异常表达与癌症的进程密切相关，可以作为肿瘤标志物，为癌症的早期诊断、预后和相关生物学功能研究提供重要信息。

然而，由于miRNA序列短、含量低、同源性高等特点，限制了miRNA的检测应用。因此，发展高灵敏度、高特异性的miRNA检测方法对实现癌症的早期诊断具有重要意义。核酸扩增技术是生物学和医学等领域的一项重要技术，广泛应用于目标物检测，可以对一些特异性的病原体或疾病标记物进行识别。其中，恒温无酶核酸扩增技术对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，且反应条件也不受酶反应环境的制约，主要包括催化发夹自组装(CHA)、杂交链式反应(HCR)和核酸酶(DNAzyme)介导的反应，适用性更强，相比于传统检测手段，该试剂盒更简单灵敏。但是目前还没有一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒，其中，所述miRNA-21的序列如表1所示，具体为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。

基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒由DNA粉末、反应底物和缓冲溶液组成，所述的DNA粉末包括发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7，具体序列如下：

H1核酸分子序列如SEQ ID NO：1，

H2核酸分子序列如SEQ ID NO：2，

H3核酸分子序列如SEQ ID NO：3，

H4核酸分子序列如SEQ ID NO：4，

H5核酸分子序列如SEQ ID NO：5，

H6核酸分子序列如SEQ ID NO：6，

和/或H7核酸分子序列如SEQ ID NO：7。

所述的反应底物包括氯化血红素、鲁米诺和过氧化氢溶液；

所述的缓冲溶液为HEPES缓冲液(10mM HEPES缓冲溶液，pH＝7.5，含有600mM氯化钠和50mM氯化钾)。

发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9：0.3-0.8。