[发明专利]一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用

说明书

本发明公开了一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用，该标记方法能够被应用于喹乙醇或者庆大霉素的检测中。本发明中制备的喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物结构更稳定，荧光信号更强，检测灵敏度更高。新型双功能螯合剂2‑S‑(4‑氨基苯)‑1，4，7，10四氮杂环壬烷‑1，4，7，10‑四乙酸具有四氮闭环结构特征，能更好的结合Eu³⁺离子，结合位点环形包围住Eu³⁺离子，复合物更稳定，荧光强度和信号更好，检测灵明度更高，检测效果更佳。

技术领域

本发明属于荧光免疫分析技术领域，具体涉及一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用。

背景技术

喹乙醇(Olaquindox，OLA)是一种抗菌促生长剂，曾广泛应用于水产养殖，一度被称为“水产瘦肉精”。喹乙醇的毒副作用不容小觑，存在明显的遗传毒性和蓄积毒性，因此国内外相继制定了严格的使用规范和残留限量标准。如美国和欧盟禁止使用喹乙醇，日本规定喹乙醇在动物组织和内脏中的最大残留限量(MRL)为300μg·kg^-1，我国农业部在2001年发布的第168号公告《饲料药物添加剂使用规范》中规定饲料中的添加量不得高于50mg·kg^-1，同时规定禁止在鱼、禽及体重超过35kg猪的养殖过程中使用。尽管如此，抗菌促生长效果好且廉价的喹乙醇目前仍被违规添加使用。因此，加强喹乙醇的检测监督，特别是加强喹乙醇检测技术的研究极为必要。

喹乙醇的残留检测方法，主要包括传统的仪器分析和免疫分析两大类。其中仪器法主要包括光谱法、色谱法以及液质联用技术等，仪器分析准确度高、精密度强，但其样品前处理过程复杂繁琐、耗时长、需要专业技术人员操作、仪器试剂等价格昂贵，无法在基层得到极大推广。免疫分析技术凭借着其高效、快速、高灵敏度以及高特异性等优势广泛应用于小分子药物残留检测中。目前，酶联免疫吸附实验(ELISA)的应用最广泛、发展最成熟，关于ELISA的各种检测报道非常多，但国内外尚未有关于喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)检测方面的任何报道，因此开发一种喹乙醇时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)的检测方法有重要意义。

时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)是近年来发展迅速的一种检测手段。现有技术中，采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法检测喹乙醇等物质，荧光性号较弱，灵敏度不高。

因此，提供一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法是非常必要和有意义的。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法，包括以下步骤：

(1)将2-10mg 2-S-(4-氨基苯)-1，4，7，10四氮杂环壬烷-1，4，7，10-四乙酸溶解于2mL，0.01mol·L^-1、pH＝7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，制得DOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；

(2)向A液中加入200-700μL 20mmol·L^-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；

(3)称取10-30mg纯化后的单克隆抗体冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L^-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；

(4)将B液逐滴加入C液中，然后调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；

(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，0.01mol·L^-1，pH＝7.4的HEPES缓冲液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；