[发明专利]一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板及构建方法、mRNA的体外转录方法和应用

权利要求书

1.一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板的构建方法，包括以下步骤：(1)将mRNA的DNA模板构建到载体pCI-Neo中，提取质粒，得第一重组质粒；所述mRNA的DNA模板的结构自5’端至3’端，依次包括：ARCA帽子类似物、5’UTR、目的基因开放编码框、3’UTR和PolyA结构；

(2)以所述第一重组质粒为模板，利用PCR方法扩增目的基因的双链DNA片段并钝端修复，连接入线性质粒pJAZZ-OK中，得所述mRNA模板。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述目的基因开放编码框包括FMC63和IL21，所述FMC63的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述IL21的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，包含FMC63的mRNA的DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；包含IL21的mRNA的DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，在步骤(2)连接入线性质粒pJAZZ-OK后，还包括将连接产物转化TSA感受态，挑取单菌落进行测序鉴定，将测序正确的重组子抽提质粒，得第二重组质粒。

5.利用权利要求1～4任一项所述构建方法构建得到的mRNA模板。

6.利用权利要求5所述mRNA模板体外一步转录mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用所述mRNA模板配制反应体系，37℃反应4h，纯化得mRNA；

所述反应体系以20μL计，包括：T72×ARCA/NTP 10μL、10×T7 Reaction Buffer 2μL、mRNA模板1μg、T7 Enzyme Mix 2μL和余量的无核酶水。

7.利用权利要求6所述方法制备得到的mRNA在编辑NK细胞中的应用。

8.一种在NK细胞上表达嵌合抗原受体结构或细胞因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求6所述方法制备得到的mRNA转染NK细胞。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述NK细胞包括NK92细胞。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述NK细胞数量与mRNA的比值为1×10⁷细胞：10～15μg。