[发明专利]一种红芽芋小滴玻璃化超低温疗法脱毒的方法

说明书

本发明公开了一种红芽芋小滴玻璃化超低温疗法脱毒的方法，属于农业生产技术领域。该方法包括：采用梯度升温法预处理红芽芋茎尖；取茎尖0.5‑1.5cm，转入基础培养基上，光照培养1‑3天；之后转入含糖培养基中装载20‑30min，再用PVS2脱水10‑20min，然后在液氮中保存1‑2天；解冻后，再用洗涤液洗涤，之后转入固体培养基中暗培养2‑3天，然后光照条件下培养20‑30天，分化出新芽；将所述新芽转入所述固体培养基培养，得到红芽芋脱毒苗。本发明通过梯度升温和包埋剂处理红芽芋茎尖后，可以初步脱毒并且保持茎尖细胞高分化能力，再结合小滴玻璃化法和超低温处理进一步脱毒，利于提高脱毒率和脱毒苗的成活率。

技术领域

本发明涉及农业生产领域，特别是涉及一种红芽芋小滴玻璃化超低温疗法脱毒的方法。

背景技术

红芽芋是江西省铅山县传统优势产品，种植历史悠久。随着该产业的迅速发展，红芽芋种植已经成为铅山县农民增收致富的主要经济来源，铅山县也成为江西省最大的红芽芋生产基地，2007年3月被中国绿色食品委员会和农业部命名为“红芽芋全国绿色食品标准化生产基地县”。正是由于近些年红芽芋发展势头猛增，在栽培种植中长期采用无性繁殖的方法获取种苗，导致病毒日益累积，种性退化，产量、品质等逐渐下降，造成了较严重的经济损失。而目前没有任何针对病毒病的有效药物，只能预防为主，其中无病毒种苗的获取将成为解决上述问题的关键手段之一。

为了避免病毒给栽培带来巨大危害，实现红芽芋无病毒栽培是铅山县红芽芋产业重新振兴的重要举措。目前，脱毒苗主要是通过高温脱毒法、茎尖培养脱毒法、茎尖微嫁接技术、热处理结合茎尖脱毒法等方法，这些方法虽然也能在一定程度上实现脱毒作用，但是存在如脱毒效率低、脱毒苗成活率低等问题，而近些年，超低温脱毒也在不断的应用，比如Wang QC教授及其团队用超低温保存成功脱除了甘薯病毒；栾爱萍发现，非洲菊2.0mm茎尖超低温保存后，可完全脱除黄瓜花叶病毒(CMY)和烟草花叶病毒(TMV)。目前，也有采用超低温方法对红芽芋进行脱毒的相关报道，但是采用单纯的超低温方法脱毒，红芽芋脱毒率也仅在45％左右，并且存在由于脱毒不彻底导致脱毒苗栽培成活率低下的问题，这对于依靠红芽芋种植为主要经济来源的铅山县而言，远远不能解决根本的问题。因此，亟需一种新的脱毒方法，提高脱毒率和脱毒苗的成活率，以解决目前铅山县红芽芋栽培存在的问题。

发明内容

本发明的目的是提供红芽芋小滴玻璃化超低温疗法脱毒的方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过梯度升温和包埋剂处理红芽芋茎尖后，可以初步脱毒并且保持茎尖细胞高分化能力，再结合小滴玻璃化法和超低温处理进一步脱毒，利于提高脱毒率和脱毒苗的成活率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种红芽芋小滴玻璃化超低温疗法脱毒的方法，包括以下步骤：

步骤1：采用梯度升温法预处理红芽芋茎尖；

步骤2：经步骤1处理后的红芽芋茎尖取0.5-1.5cm，转入基础培养基上，光照培养1-3天；之后转入含糖培养基中装载20-30min，再用PVS2脱水10-20min，然后在液氮中保存1-2天；所述基础培养基为MS+0.5-1.5mg·L-1KT+0.1-0.35mg·L-1NAA+0.1-0.4M壳寡糖；所述含糖培养基为MS+0.5M甘油+0.1-0.5M蔗糖；

步骤3：从液氮中取出红芽芋茎尖并浸入预热的洗涤液解冻，再用洗涤液洗涤，之后转入固体培养基中暗培养2-3天，然后光照条件下培养20-30天，分化出新芽；所述固体培养基为MS+0.5-1.5mg·L^-1KT+0.05-0.25mg·L^-1NAA；

步骤4：将所述新芽转入所述固体培养基培养，得到红芽芋脱毒苗。

优选的是，步骤1中，所述采用梯度升温法预处理红芽芋茎尖，具体包括：