[发明专利]一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法及应用

权利要求书

1.一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）脱细胞脂肪的制备：

a.取新鲜来源的脂肪在-80℃至37℃的条件环境下冷冻复融3～5次，每次1~2h，然后取冻融后的脂肪剪碎或采用均质、离心处理后保留脂肪层；

b．将步骤a中直接剪碎的脂肪或收集的脂肪层置于Trypsin-EDTA消化液中振荡消化16h~24h后，然后用PBS缓冲液洗涤3~5次，每次30~60 min，然后置于异丙醇中振荡浸泡处理48h~72h，每24h换液一次，并用PBS缓冲液洗涤后再次用体积浓度为1%~3% 的Triton X-100去污剂振荡消化1h~2h，PBS缓冲液洗涤3~5次后，再次在Trypsin-EDTA消化液中振荡消化4h~6h；

c.将步骤b中振荡消化后的脂肪采用PBS缓冲液洗涤，并使用Benzonase浓度大于≥100U/mL的PBS溶液振荡处理16h~24h，再次使用异丙醇振荡浸泡处理8h~12h后，采用 PBS缓冲液洗涤，最后使用乙醇消毒液浸泡3～5次得到灭菌后的脱细胞脂肪，每次浸泡时间为30min~60min；

（2）肝素化脱细胞脂肪的制备：

a.在浓度为0.1 mol/L的MES缓冲液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和肝素钠配制成MES缓冲液混合溶液，并在室温下反应孵育15min~30min；其MES缓冲液混合溶液中， 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度比为3:5，肝素钠的质量分数为0.5%~1.5%；

b.取步骤（1）中制备的脱细胞脂肪按照质量百分比1%~2%加入步骤a中反应后的MES缓冲液混合溶液中，并在温度为25℃~37℃、振荡频率为60rpm~120rpm的条件下振荡反应16h~24h得到肝素化脱细胞脂肪；将反应后得到肝素化脱细胞脂肪使用Na₂HPO₄溶液洗涤30min~60min后，再使用NaCl溶液洗涤3～5次，每次30min~60min，最后用无菌PBS缓冲液洗涤3～5次，每次10 min ~30min，并将洗涤后的肝素化脱细胞脂肪保存于无菌离心管中；

（3）负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪的制备：取步骤（2）中制备的肝素化脱细胞脂肪切碎直至形成均匀的凝胶状匀浆，按照每mL无菌bFGF溶液加入2000mg肝素化脱细胞脂肪的比例浸泡于浓度为1μg/mL～5μg/mL的无菌bFGF溶液中，并在4℃条件下孵育16h~24h；然后，取出反应后的肝素化脱细胞脂肪，并用无菌PBS溶液清洗3～5次，每次3~5min，洗脱未交联的bFGF后即得到负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料，并将其置于4℃无菌保存。

2.根据权利要求1所述的一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的a步骤中所述的新鲜脂肪为鼠来源、兔来源或人来源；将新鲜脂肪冻融后直接切碎成0.5x0.5cm的小块；或者将新鲜脂肪冻融后加入等体积的去离子水，采用均质器在转速12000～15000 rpm的转速下均质5～10min；并将均质处理后的组织悬浮液在离心转速为1500~3000 rpm的条件下离心5~10 min，去除最上层黄色油脂及最下层水分，保留中间的脂肪层。

3.根据权利要求1所述的一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的b步骤中的Trypsin-EDTA消化液的质量浓度为0.05%~0.25%。

4.根据权利要求1所述的一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的c步骤中的乙醇消毒液为体积浓度75%的乙醇或含有过氧乙酸的乙醇水溶液，其中，含有过氧乙酸的乙醇水溶液中过氧乙酸的体积百分比为0.1%，乙醇的体积百分比为4%。