[发明专利]编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子及其用途

说明书

本发明提供了一种编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子，其包含如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种包含本发明所述的DNA分子的表达载体和用于表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌。本发明还提供了一种使用本发明的工程菌制备L‑瓜氨酸的方法。本发明提供的基因工程菌具有很高的催化精氨酸生成L‑瓜氨酸的能力，极大地提高了表达效率，从而降低了生产和使用成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种编码精氨酸脱亚胺酶的DNA分子，本发明还涉及包含该DNA分子的载体以及其用于生产L-瓜氨酸的用途。

背景技术

L-瓜氨酸，又名氨基甲酰鸟氨酸，1914年右贺太郎等从西瓜榨汁中第一次分离得到了瓜氨酸，此后由和田光德确认它是一种氨基酸。瓜氨酸以游离态存在于葫芦科植物的种子中，至今为止，人们已成功地从西瓜榨汁、野西瓜叶、核桃仁、核桃幼苗及种子中分离得到了瓜氨酸。

瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，近年来国外的众多研究表明，瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，作为异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，应用前景十分广阔。

L-瓜氨酸的主要生产方法有提取法、化学合成法、微生物发酵法、酶转化法。酶法生产L-瓜氨酸具有生产周期短、专一性强、产物纯化容易等优点，其逐渐成为瓜氨酸的主要生产方式。但是在利用工程菌对精氨酸脱亚胺酶进行表达时候，大部分精氨酸脱亚胺酶以没有活性的包涵体形式存在。公开号为CN105018454A的中国专利申请公开了一种大肠杆菌重组表达精氨酸脱亚胺酶的制备方法，主要包括重组表达方法、采用尿素作为变性剂的包涵体复性方法。但是该复性过程增加了酶的成本，降低了产品竞争力。

精氨酸的分子量为174.2，等电点为10.76，属于碱性氨基酸，在水溶液中的pH为10以上，但是目前报道的精氨酸脱亚胺酶的最适合pH为6-7，因此在进行酶促反应时候需要先用浓盐酸将反应液的pH进行调节到6-7的范围内，随着底物精氨酸浓度的提高，盐酸的用量会逐渐增大，最终酶反应液中的离子浓度会很高，容易影响酶的活性甚至造成酶的失活，影响整个酶催化反应。同时由于精氨酸脱亚胺酶属于单一酶，在进行酶催化的时候不需要辅酶的参与，因此利用固定化酶进行酶促反应，提高酶的使用次数，是生产瓜氨酸的主要方向。但是固定化酶要求稳定性较高的酶，因此对耐温度、pH稳定性高，可溶性表达量高，活力高的精氨酸脱亚胺酶的需求越来越迫切。

同时酶的热稳定性对于酶的重复利用也非常关键，热稳定性好的酶具有可以提高反应速率、简化提取纯化工艺、降低成本、提高产品品质、活性稳定、容易储存等优点，因此寻找热稳定性好的酶也一直是生产和科研关注的热点。

公开号为CN104560927A的中国专利申请公开了一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用，所述突变的精氨酸脱亚胺酶在K137A、F198W、V230A、R257L、A260D中的任意一个或多个位点发生突变，突变后的精氨酸脱亚胺酶的活性明显提高，可用于催化L-精氨酸生产L-瓜氨酸，转化率在95％以上。突变的精氨酸脱亚胺酶采用易错PCR体系制备得到。液体酶活达到200000-270000U/L，精氨酸投料量在258g/L的情况下，用浓盐酸调节pH6-7，经过5.5h转化，转化率达到了96.5％，突变后的活性虽然得到了提高，但是当底物浓度大于200g/L时，反应结束后还有底物剩余。

公开号为CN106591271A的中国专利申请公开了一种精氨酸脱亚胺酶突变体，其为酶活性中心附近的甘氨酸突变为脯氨酸的突变体，突变体与野生酶相比其酶活力提高了1.5倍，在40℃下的半衰期提高了5.43倍，解决了精氨酸脱亚胺酶催化瓜氨酸合成时催化能力和温度稳定性低的问题，但是该反应的底物浓度为100g/L，pH为6.0-6.5，转化率为95％，40℃的半衰期为100min左右，不利于酶的长期保藏和使用。

基于此，当前对具有很好的热稳定性、pH稳定性的精氨酸脱亚胺酶仍存在需求。

发明内容