[发明专利]一种基于纳米金聚集的卡那霉素均相生物传感方法及其应用

权利要求书

1.一种基于纳米金聚集的卡那霉素均相生物传感方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）DNA链的预处理

取3个PV管并分别编号为#1、#2、#3，向#1 PV管中加入80 µL浓度为10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有100 mM NaCl、40 mM KCl、10 mM MgCl₂；

向#1 PV管中加入10 µL 浓度为10 µM卡那霉素核酸适配体溶液S1和10 µL 浓度为10µM Mg²⁺核酸酶链S2；所述卡那霉素核酸适配体S1的碱基序列为5’-ACGTAA CAT GGG GGTTGA GGC TAA GCC GAC TAG T-3’，所述Mg²⁺核酸酶链S2的碱基序列为5’-ACT AGT CAG CGATCA CCC ATG TTA CGT AA-3’；

向#2 PV管中加入10 µL浓度为40 µM的发夹探针H1，所述发夹探针H1的碱基序列为5’-SH-(CH₂)₆-TTT TTT TTT TGG GTA GGG TCT TAC GTAT (rA) GGA CTA GTC AGC GAT CGGGAC CCT ACC-3’，其中H1中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；

向#3 PV管中加入10 µL浓度为40 µM的发夹探针H2，所述发夹探针H2的碱基序列为5’-GGT AGG GTC CCG CAC CCA TGT TAC GTAT (rA) GGA CTA GTG GTG CGG GTT GGG TTT TTTTTT T- SH-(CH₂)₆ -3’，其中H2中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；

将#1 PV管中的溶液加热至95 ^oC，保持5 min后缓慢降温2 h至室温，得到稳定的杂交双链S1/ S2溶液；再将#2、#3 PV管中的溶液均加热至95 ^oC，保持5 min后缓慢降温2 h至室温，分别得到稳定的发夹茎环结构H1溶液和发夹茎环结构H2溶液；

（2）功能化金纳米粒子的制备

取2支PV管并分别编号为#4、#5，向每个PV管中加入1.0 mL 粒径为13 nm 金纳米粒子，离心弃去上层清液后重新分散于装有1.0 mL 浓度为10 mM pH=7.4 的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液和质量分数为0.01 % 吐温-20的混合溶液中，再用浓度为0.1 M K₂CO₃调至溶液的pH=8；

向#4管中加入10 μL步骤（1）中得到的浓度为40 µM稳定的发夹茎环结构H1溶液，向#5PV中加入10 μL步骤（1）中得到的浓度为40 µM稳定的发夹茎环结构H2溶液，将#4和#5管在室温缓慢搅拌反应12 h之后，再分别往#4和#5 PV管中逐滴加入浓度为1.0 M的NaCl溶液，至PV管中NaCl浓度为0.1 M，每次加入NaCl溶液的时间间隔大于0.5 h；再于37 ^oC条件下继续涡旋反应24 h以促进Au NP/H1和Au NP/H2的形成；最后，于10000 rpm转速条件下离心15min弃去上层清液，将收集所得到的Au NP/H1和Au NP/H2产物用浓度为10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液反复离心洗涤三次后分散至1 mL含有质量分数为0.5 % BSA、100 mM NaCl、40 mM KCl 和10 mM MgCl₂的10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液中，于4 ^oC保存待用；

（3）均相反应测定标准溶液中卡那霉素的含量

取7支PV管，向每支PV管中加入40 μL含有100 mM NaCl、40 mM KCl 和10 mM MgCl₂的10mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液；接着向每支PV管中加入经步骤（1）退火处理后的10 μL 浓度为1 μM杂交双链S1/ S2溶液，再向每个PV管中分别加入50 µL含有卡那霉素的浓度梯度为0、0.0001 ng/mL、0.001 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1 ng/mL和10 ng/mL10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，最后向每个PV管中加入50 µL Au NP/H1和50 µL Au NP/H2，于37 ^oC涡旋混匀反应120 min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系；

（4）样品中卡那霉素含量的检测

取处理后的样品溶液50 µL，加入40 μL含有100 mM NaCl、40 mM KCl 和10 mM MgCl₂的10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液；接着往其中加入经步骤（1）退火处理后的10 μL 1 μM杂交双链S1/S2溶液，再加入50 µL Au NP/H1和50 µL Au NP/H2，于37^oC涡旋混匀反应120 min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据步骤（3）中得到的吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中卡那霉素的含量。

2.如权利要求1所述的一种基于纳米金聚集的卡那霉素均相生物传感方法在检测样品中卡那霉素含量中的应用。