[发明专利]水稻微丝解聚因子ADF6转基因植株的培育、鉴定及应用

权利要求书

1.一种重组载体，其特征在于：该重组载体包括序列如SEQ ID NO.1所示OsADF6基因，通过DNA连接酶将OsADF6基因连接到载体。

2.包括有权利要求1所述的重组载体的转化细胞。

3.一种转OsADF6基因拟南芥的培育方法，其特征在于：该方法以水稻为材料获得目的基因OsADF6，通过酶切连接与植物表达载体pCAMBIA1300-221质粒进行重组连接，通过农杆菌介导法将OsADF6基因导入拟南芥。

4.一种转OsADF6基因拟南芥的培育方法，该方法包括如下步骤：

(1)水稻OsADF6基因的克隆

以水稻根为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据转录组测序所得到的序列信息设计特异性引物：

正向引物OsADF6-F：序列如SEQ ID NO.2所示

反向引物OsADF6-R：序列如SEQ ID NO.3所示；获得OsADF6基因序列；

结合PCR扩增目的基因的全长序列，在OsADF6基因的上游和下游分别引入XbaI和SmaI酶切位点，设计引物：

正向引物OsADF6-2F：序列如SEQ ID NO.4所示

反向引物OsADF6-2R：序列如SEQ ID NO.5所示；获得PCR产物；

(2)植物表达载体pCAMBIA1300-221-OsADF6的构建

将步骤(1)获得的PCR产物连接到pGM-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；

用限制性内切酶XbaI和SmaI分别对提取的质粒及pCAMBIA1300-221载体进行双酶切，酶切产物经PCR电泳检测后回收；用T4连接酶过夜连接回收的酶切产物；将连接产物转化DH5α大肠杆菌，提取阳性质粒并进行双酶切验证。

(3)农杆菌GV3101介导遗传转化法转化拟南芥

将步骤(2)制备的阳性质粒pCAMBIA1300-221-T-OsADF6转化农杆菌感受态GV3101，获得阳性克隆农杆菌，通过浸染法转化拟南芥，将OsADF6基因转入拟南芥中，获得转基因植株。

5.权利要求1所述的重组载体在培育转基因拟南芥上的应用。

6.权利要求2所述的转化细胞在培育拟南芥上的应用。

7.权利要求3或4所述的转OsADF6基因拟南芥的培育方法在抗旱性转基因拟南芥株系培育上的应用。

8.通过权利要求3或4所述的培育方法获得抗旱性转基因拟南芥的应用。

9.转OsADF6基因拟南芥的鉴定方法，其特征在于，该鉴定方法将转OsADF6基因初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因拟南芥株系。

具体步骤如下：

(1)PCR检测

提取生根筛选得到的卡那霉素抗性待检测植株基因组DNA，将筛选基因NPTII作为检测目标，根据NPTII基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为430bp，引物序列为：

正向引物pCAMBIA1300-221-NPTII-F：序列如SEQ ID NO.6所示；

反向引物pCAMBIA1300-221-NPTII-R：序列如SEQ ID NO.7所示；

分别以卡那霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以pCAMBIA1300-221-NPTII-F和pCAMBIA1300-221-NPTII-R为引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

(2)荧光定量RT-PCR检测

分别提取抗卡那霉素植株根及野生型植株根的RNA、反转录合成cDNA，进行荧光定量RT-PCR检测(每个样品重复3次)。根据荧光定量RT-PCR检测数据分析得到各个样品的CT值，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株的相对表达情况；特异引物扩增出的片段长为97bp，引物序列为：

正向引物OsADF6-RT-F：序列如SEQ ID NO.8所示，

反向引物OsADF6-RT-R：序列如SEQ ID NO.9所示；

以18S扩增的基因片段为内参，片段长度为186bp阳性结果，引物序列：

正向引物18S-F：序列如SEQ ID NO.10所示，

反向引物18S-R：序列如SEQ ID NO.11所示；

由PCR、荧光定量RT-PCR检测呈阳性，确定获得转基因拟南芥株系。