[发明专利]一种梨叶原生质体的提取方法

说明书

本发明公开了一种梨叶原生质体的提取方法。属于原生质体技术领域。本发明采用梨组培苗叶片，解决了田间苗易褐化、无法制备完整原生质体的问题，打破了梨原生质体制备的瓶颈；采用本发明酶解液，提高了提取效率并保证了原生质体的结构完整；采用本发明的方法制备梨叶原生质体，可提高原生质体的浓度，保持原生质体的完整性及活性，制备的梨叶原生质体浓度可达10⁶个/ml。

技术领域

本发明涉及原生质体技术领域，更具体的说是涉及一种梨叶原生质体的提取方法。

背景技术

梨属蔷薇科(Rosaceae)梨属(PyrusL.)植物，是我国重要的水果树种之一，具有很高的经济价值和保健功能。当前梨主要通过自然选种、有性杂交筛选后代等传统方式进行新品种选育，这些方式耗时长且选育效率较低。随着生物技术的日益成熟，结合基因组学、分子生物学的生物技术育种逐渐打破一些常规育种的局限而成为新的育种方式。然而梨目前仍没有建立高效稳定的遗传体系，这直接阻碍了生物技术育种及功能基因组学等的发展。

原生质体是细胞壁以内各种结构的总称，由于没有细胞壁等特点，相比于含有细胞壁的细胞而言，不仅保持了细胞的全能性的特点，而且更易接受外源的遗传物质，使外源DNA在原生质体中快速表达。研究表明，原生质体不仅可作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料，同时还是原生质体培养和原生质体融合的基础。

由于梨的组织是易褐变的材料，所以在制备原生质体的处理中，将梨叶片切成细丝这一过程中，极易产生褐变，即使添加抗氧化剂也很难抑制褐变发生。这也是梨制备原生质体不易成功的原因。

综上，如何提供一种防止褐变、浓度高的梨叶原生质体的提取方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种梨叶原生质体的提取方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种梨叶原生质体的提取方法，包括如下步骤：

(1)将梨叶片置于酶解液中酶解，得到酶解产物，所述酶解液包括如下质量浓度的组分：纤维素酶0.5％～2.0％w/v、离析酶0.2％～0.5w/v、果胶酶0.1～0.5％w/v、甘露醇0.3～0.7mol/L、2-(N-吗啉基)乙磺酸20mM、氯化钾20mM、氯化钙10mM和0.05～0.1％牛血清蛋白；

(2)向所述酶解产物中加入等体积的W5清洗液，过筛取滤液，所述W5清洗液包括如下质量浓度的组分：2-(N-吗啉基)乙磺酸2mM、氯化钾5mM、氯化钙125mM、氯化钠154mM和葡萄糖5mM；

(3)将所述滤液离心后得沉淀，洗涤后得梨叶原生质体。

所取得的有益效果：纤维素酶+离析酶+果胶酶组合使用，可以有效的酶解细胞壁，分离原生质体，保持原生质体的完整度。

w5清洗液中的氯化钾、氯化钙、氯化钠等无机盐可有效保持原生质体膜的稳定。为原生质体提供稳定的渗透势，防止细胞破碎，有效保证了原生质体生理状态及完整度。W5清洗液配置方法简单，使用方便。

进一步的，步骤(1)中所述梨叶片为苗龄为30～50d的梨组培苗叶片。

所取得的有益效果：梨组培苗叶片在同样条件下，褐变程度显著轻于田间采集的叶片。本发明采用梨组培苗叶片，解决了田间苗易褐化、无法制备完整原生质体的问题，打破了梨原生质体制备的瓶颈。

进一步的，步骤(1)中所述梨叶片和酶解液的质量体积比为1:10。

进一步的，所述步骤(1)中的酶解条件为25～28℃、黑暗条件下、静置酶解11～12h。

进一步的，酶解前将所述梨叶片处理成0.5～1mm宽的丝。