[发明专利]一种高产D-泛酸的基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，通过以下步骤构建获得：

（1）以保藏号为CCTCC NO：M2018914的大肠杆菌为出发菌株，敲除aceF和mdh两个基因，获得菌株DPA02；

（2）将来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因，以及ppnk基因在菌株DPA02中过表达获得高产D-泛酸的基因工程菌，

aceF基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；mdh基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；panB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ppnk基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，

步骤（2）中将panB基因、panC基因以及ppnk基因同时克隆到pTrc99A质粒中，获得质粒pTrc99A-panBC-ppnk，将该质粒转入菌株DPA02中进行独立过表达，获得高产D-泛酸的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，敲除aceF和mdh两个基因时使用CRISPR-Cas9基因编辑技术。

3.如权利要求1或2所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵过程中控制发酵体系pH维持在6.6~6.8，温度维持在28~30℃。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，在发酵延迟期添加2 g/L的甜菜碱，缓解发酵系统中所述基因工程菌对渗透压的敏感。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵起始时使用发酵培养基，并依据20%溶氧反馈补料策略，将补料培养基补加至发酵系统，

所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10~20 g/L、(NH₄)₂SO₄ 12~16 g/L、KH₂PO₄ 1~2 g/L、MgSO₄ 0.3~0.5 g/L、酵母提取物1~2 g/L、0.5~1 ml/L微量元素溶液，50~75 mg/L Kan抗生素，0.1~0.2 mM的IPTG，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：5~10 g/LCoCl₂、5~10 g/L FeSO₄·7H₂O、0.5~1 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.10~0.20 g/L CuSO₄、0.01~0.02g/L NiCl₂·7H₂O，溶剂为去离子水；

补料培养基：葡萄糖400~500 g/L，酵母提取物 1~2g/L，硫酸铵8~10 g/L，硫酸镁6~8g/L，磷酸二氢钾10~14 g/L，β-丙氨酸35~40 g/L，异亮氨酸0.1~0.16 g/L，VB₁ 8~10 mg/L，VB₁₂ 2~4 mg/L，Kan抗生素 50~75 mg/L，IPTG 72~96 mg/L，金属盐溶液1~2 mL/L，消泡剂1~2 mL/L。