[发明专利]一种特异性扩增野生动物源成分的引物组、检测体系及试剂盒

说明书

本发明公开了一种特异性扩增野生动物源成分的引物组、检测体系及试剂盒。所述引物组包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.40所示的20对引物对。所述检测体系即试剂盒均采用所述引物组特异性扩增待测样品中的白狐、孔雀、猪獾、猴、鹿、貉、龟、蛇、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、竹鼠、犀牛、金雕、熊、巨蜥、河马和鹦鹉的野生动物源成分。具有精确度好、灵敏度高、稳定易操作等优点。多重荧光PCR反应是在同一管内进行的，不易污染，且具有特异性强、通量大等优势，此外，整个检测过程可在2‑3小时内完成，能够满足样品快速检验要求。

技术领域

本发明涉及生物样品检测技术领域，特别涉及一种特异性扩增野生动物源成分的引物组及检测体系。

背景技术

目前，根据《濒危野生动植物种国际公约》的最新统计资料显示，野生动物已经成为世界上仅次于毒品和武器的第三大走私对象，一年的非法贸易交易金额高达50亿美元。交易对象主要有野生动物活体及其皮毛、药材以及加工成装饰品、奢侈品等，由于其利润之高，导致几千种野生动物被推到了濒临灭绝的边缘，每一种物种的绝迹，都预示着很多物种即将面临死亡，保护生物链才能更好地维系生态平衡。

由于野生动物物种鉴定、价值鉴定等是刑事案件立案侦查和准确定性量刑的依据，为加强打击野生动物违法犯罪力度，对涉案的野生动物鉴定需求随之增加。但案件中的野生动物往往经过加工处理成皮张、龟壳、角制品和玳瑁制品等，无法通过宏观形态学鉴定，因此需要利用以DNA为研究对象的遗传学方法，从分子水平进行分析，能够实现快速、准确和自动化的物种鉴定。

基于DNA的种属鉴别方法主要有聚合酶链式反应(PCR)、多重PCR、荧光定量PCR、LAMP等。传统的PCR方法一次只能用一对引物鉴定一个物种，对于两种及以上的物种，则需要分别进行PCR检测达到鉴定目的，耗时长且操作繁琐；荧光定量PCR具有灵敏度高，操作简便，能进行定量分析等优点，但检测通量小，实验操作所需的荧光定量PCR仪及试剂价格昂贵，而且多数情况下，种属鉴定只要求定性检测。

发明内容

本发明目的在于提供一种特异性扩增野生动物源成分的引物组、检测体系及试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

本发明第一方面提供一种特异性扩增野生动物源成分的引物组，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.40所示的20对引物对，能同管分别特异性扩增20种不同的野生动物源成份。所述野生动物源成份包括白狐、孔雀、猪獾、猴、鹿、貉、龟、蛇、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、竹鼠、犀牛、金雕、熊、巨蜥、河马和鹦鹉。

本发明第二方面提供一种包含上述特异性扩增野生动物源成分引物组的检测体系。检测体系中进一步还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的通用引物对，该通用引物根据所有脊柱动物线粒体DNA12S rRNA的公共保守序列设计，产物片段范围为400-500bp，用于判定待测DNA模板的有效性。因此检测体系中包含的引物序列如表1所示：

表1检测体系所含引物序列

由于细胞中线粒体DNA随线粒体独立复制，进化速度快，不受核基因影响，并且为严格的母系遗传，几乎不发生倒位、易位等畸变与重组，忠实地保存了进化过程中的突变，因此从上述20种野生动物的线粒体筛选合适的标靶基因序列[如12SrRNA、16SrRNA、细胞色素b(cytb)、细胞色素C氧化酶亚基I(COI)等]，挑选各基因序列的保守区域。通过基因序列对比分析，分别确定cytb基因作为孔雀、猪獾、貉、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、犀牛、竹鼠、熊、鹦鹉鉴别的靶基因；确定COI基因作为白狐、龟、金雕、蛇、鹿、猴鉴别的靶基因；确定16SrRNA基因作为巨蜥、河马鉴别的靶基因。