[发明专利]一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述的三种分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合群(MTBC)、禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)和禽分枝杆菌禽亚种(MAA)。所述的试剂盒中含有分别用于检测MTBC、MAP和MAA的引物以及探针。进一步的，本发明还建立了使用上述试剂盒检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR方法，实验证明，本发明建立的多重TaqMan荧光定量方法与常规PCR的阳性符合率为100.0％(175/175)、阴性符合率为87.0％(220/253)，与分枝杆菌培养的阳性符合率为100.0％(116/116)、阴性符合率为69.6％(220/316)。因此，本发明所建立的多重TaqMan荧光定量方法可用于MTBC、MAP和MAA的定性和定量检测，为有效防控牛结核病和副结核病提供了新的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种可同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒，还涉及该试剂盒在检测结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)、禽分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP)以及禽分枝杆菌禽亚种(Mycobacterium avium subsp.avium，MAA)中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

分枝杆菌是一类在形态学上表现为平直或微弯的杆菌，呈分枝状或丝状，大小在0.2×0.6μm-2.0×10μm之间，无鞭毛、芽孢和荚膜(DARK，2013)，革兰氏染色阳性。因其能抵抗3％盐酸酒精的脱色作用而称为抗酸菌，实验室常用抗酸染色法(Ziehl-Neelsen染色法)进行染色鉴定(GAZI et al.，2015)，分枝杆菌染成红色，而其他非抗酸菌则呈蓝色。

分枝杆菌属细菌成员众多(GUPTA，2018)，目前LPSN(https：//lpsn.dsmz.de/)公布的分枝杆菌已有230余种，主要分为三大类，即结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosis complex，MTBC)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和除MTBC和麻风分枝杆菌以外的所有分枝杆菌，统称为非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria，NTM)(Jagielski et al.，2014)。近年来，由NTM引起的传染病在世界范围内的流行率有所增加，其中最常见的是脓肿分枝杆菌复合群(Mycobacterium abscessus complex)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)和禽分枝杆菌复合群(Mycobacterium aviumcomplex，MAC)(BUSATTO et al.，2019)。

MTBC包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，MB)、坎纳分枝杆菌(Mycobacterium canettii)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、海豹分枝杆菌(Mycobacterium pinnipedii)、山羊分枝杆菌(Mycobacterium caparae)、羚羊分枝杆菌(Mycobacterium orygis)和海狮分枝杆菌(Mycobacterium mungi)(KANABALAN et a1.，2021)。