[发明专利]一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株产胞外蛋白能力和淀粉能力强的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA‑HS；将此菌株接种至发酵培养基中发酵，即可使发酵上清淀粉酶的表达量高达60U/mL；以此菌株为宿主表达编码1,4‑α‑葡聚糖分支酶的基因构建得到的重组菌接种至发酵培养基中发酵，可得发酵上清中1,4‑α‑葡聚糖分支酶的酶活最高达300U/mL。本发明方法在自然界筛选出解淀粉芽孢杆菌，根据特性分析找到淀粉酶和蛋白酶较高的菌株，针对性地探索野生解淀粉芽孢杆菌的电转条件，并对其进行优化，从而提高转化效率并成功表达异源蛋白。

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种广泛分布、嗜温、好氧并产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，已被美国食品药品管理局(FDA)认定为GRAS(Generallyrecognized as safe)菌株。解淀粉芽孢杆菌不仅具有很强的抗逆性，还能能分泌大量酶类和产生抗菌物质，因此，一方面作为活菌剂被广泛应用在饲料、生防、环保等领域，另一方面作为表达系统在外源蛋白和代谢产物的生产中发挥重要作用。解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌具有很高的同源性，同时两者在遗传上和生化特征上存在种间差异。与枯草芽孢杆菌相比，解淀粉芽孢杆菌具有更强的蛋白分泌能力。目前，解淀粉芽孢杆菌是许多α-淀粉酶和蛋白酶等酶制剂的重要生产菌株。

尽管解淀粉芽孢杆菌具有优良的蛋白表达和分泌特性，然而相比于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌在外源蛋白表达方面的研究相对较少。这是由于解淀粉芽孢杆菌内存在DNA限制性内切修饰系统，并且外源质粒的稳定性差。限制性内切修饰系统由限制性内切酶和相应的甲基酶组成，这些酶可以识别并切断未被修饰的外源DNA，从而作为细菌细胞的防御工具。由于外源基因转化失败率高，所以很少有可靠的解淀粉芽孢杆菌作为宿主用于重组蛋白的生产。

目前，解淀粉芽孢杆菌的转化方法主要有：1)自然转化；2)原生质体转化；3)电击转化；4)原生质体电击转化。其中，电转化是一种快速、简单的转化方法。电转化的作用原理是在一定的电场强度作用下，细胞膜上形成可恢复的疏水性小孔以便外源DNA进入胞内。理论上电场强度越大，细胞表面产生的疏水性小孔越多，细胞膜通透性越好，外源DNA约容易进入胞内，但是细胞的死亡率也会随着电场强度的增加而增加。对于电转化方法，如何在转化率和细胞死亡率之间找到一个平衡点，建立最佳的电击条件非常重要。

为了改进电转的条件，已经有研究人员做出以下方面的贡献：1)在电击洗涤缓冲液中加入蔗糖、山梨醇、甘露醇或海藻糖之类的渗透剂，提高电击时细胞的存活率；2)优化细菌的收集时间或向液体培养基中加入一些能够抑制细胞壁合成的物质，如D(L)-苏氨酸、甘氨酸、抗生素(如氨苄青霉素)、溶菌酶或吐温-80等。3)对外源DNA进行内外或体内甲基化修饰，以克服宿主体内存在的限制修饰系统，避免被酶切降解。但是这些方法，都有其局限。比如，刘宇帅等人在专利(CN 110423784 A)里提及在电转培养基里加入甘氨酸能够使解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.4038的阳性转化率达到80％，但是早在2011年Zhang等人就在Enhancing electro-transformation competency ofrecalcitrant Bacillusamyloliquefaciens by combining cell-wall weakening and cell-membrane fluiditydisturbing提到加入甘氨酸和DL-苏氨酸可以削弱细胞壁，补充Tween 80进一步提高细胞膜流动性，从而使得外源质粒在解淀粉芽孢杆菌TA208中的转化率达到1.13±0.34x10⁷CFU/μg。

而且对于不同的解淀粉芽孢杆菌，也需要针对性地摸索电击转化的条件，才能取得较为理想的结果。