[发明专利]利用热响应型聚合物NPE-108分离纯化杆菌肽的方法

说明书

本发明涉及一种利用热响应型聚合物NPE‑108分离纯化杆菌肽的方法，包括：正向萃取步骤：将NPE‑108与杆菌肽发酵液按照1:4的体积比混合均匀，加入二价锰盐，调节pH至8.5，振荡均匀，放置在30℃的恒温水浴锅静置，直至形成界面清晰的两相，取出上相；反向萃取步骤：向正向萃取步骤所得的下相中，加入体积为NPE‑108体积的一半的水，混合均匀，并调节pH至5.5，静置于60℃水浴锅，直至形成界面清晰的两相，杆菌肽富集于上相中。本发明使用的热响应型聚合物NPE‑108与水混合形成可回收型的热响应型两水相体系，具有操作条件温和、环境友好、成相组分可回收的优点，有利于大规模的杆菌肽分离应用。

技术领域

本发明涉及两水相萃取技术领域，尤其是可回收型两水相体系在分离发酵液中的杆菌肽的应用，属于下游分离技术领域。

背景技术

嵌段聚醚NPE-108是一种热响应型聚合物，通过调节合成过程中EO和PO的加入比可以合成浊点不同的EOPO。NPE-108水溶液加热时，温度在NPE-108的浊点以上，聚合物NPE-108与水分离，形成界面清晰的两相，并且利用此方法还可以将NPE-108从相体系中回收，进行重复利用，这就是NPE-108/水可回收型两水相体系。

两水相体系由于其含水量高，萃取条件温和，能够保护生物分子的活性基团的优点，使其更易于工业化生物分子的分离应用。

两水相萃取技术由于其特有的优势(操作条件温和、保护生物分子的活性基团等)已在分离纯化酶、蛋白质、抗体、抗生素等生物活性物质上广泛研究。但是，该分离纯化手段目前仅在实验室阶段使用，未能进行工业化。主要因为利用两种响应型聚合物构建的两水相体系中的聚合物合成成本高、成相时间长，限制了两水相体系的工业化应用。

因此，开发一种成相时间短、成相组分的制备成本低、合成工艺成熟的可回收型的两水相体系成为当前用于生物分子分离工业化亟待解决的问题。

发明内容

本发明主要针对上面的问题，提供了一种可回收型两水相体系分离杆菌肽的工艺过程，仅使用一种热响应型聚合物NPE-108，聚合物水溶液经温度诱导即可与水发生相分离，从而实现聚合物的回收利用，可大大降低发酵液中杆菌肽的分离成本，操作简单易于工业化应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种NPE-108/水可回收型两水相体系萃取杆菌肽的工艺，包括：

正向萃取杆菌肽，正向萃取时，将NPE-108与杆菌肽发酵液以1:4体积比混合，加入二价锰盐(优选MnCl₂，在体系中的浓度为4mmol/L)，振荡均匀，调节体系的pH至8.5，将离心管放置在30℃的恒温水浴锅静置，直至观察到界面清晰的两相。该条件下，杆菌肽主要分配在NPE-108富集相；

反向萃取杆菌肽，将正向萃取后的上相取出，向刻度离心管中加入水进行第一次反向萃取，水的体积是初始加入NPE-108的体积的1/2，混合振荡均匀后，调节体系的pH至5.5，放置在60℃的恒温水浴锅静置，直至观察到界面清晰的两相，将其取出后离心，然后将反向萃取后的上相取出，向离心管中加入水(NPE-108和水的体积比为2:1)进行第二次反向萃取，调节体系的pH至5.5，放置在60℃的恒温水浴锅静置，直至观察到界面清晰的两相。经过两次反向萃取，下相中的杆菌肽被反向萃取到上相水溶液中。

本发明利用热响应型聚合物NPE-108，一种由单体环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)共聚合成的嵌段聚合物。NPE-108经过温度诱导可以与水发生相分离形成两水相体系，通过调整萃取过程中的pH实现杆菌肽在发酵液和NPE-108之间的转移。

本发明提供了亚甲基双水杨酸杆菌肽的制备方法，具体为，将亚甲基双水杨酸用NaOH溶解并调整其pH至8.5，将两次反向萃取后的上相和亚甲基双水杨酸溶液混合调节混合溶液的pH至4.5，即可观察到亚甲基双水杨酸杆菌肽沉淀，离心后，去除上清，将沉淀物放置在冷冻干燥箱(5小时)冻干，即可得到亚甲基双水杨酸杆菌肽粉末。