[发明专利]一种高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法及其应用在审
| 申请号： | 202110743911.3 | 申请日： | 2021-06-30 |
| 公开（公告）号： | CN113481309A | 公开（公告）日： | 2021-10-08 |
| 发明（设计）人： | 李炳;梁贺彬;张家禹 | 申请（专利权）人： | 清华大学深圳国际研究生院 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 北京市诚辉律师事务所 11430 | 代理人： | 李玉娜;范盈 |
| 地址： | 518055 广东省深圳市*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 灵敏 快速 定量 检测 环境 样品 新型 氯霉素 抗性 基因 方法 及其 应用 | ||
1.一种高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)环境样品的预处理以及基因组DNA的提取；
(2)目的基因的扩增；
(3)标准质粒的构建；
(4)Q-PCR标准曲线的构建；
(5)环境样品中新型氯霉素抗性基因的定量检测。
2.根据权利要求1所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(1)中所述环境样品的预处理为：将采集得到的环境样品经6000-8000rpm，4℃离心5-10分钟，弃上清后收集沉淀，然后将沉淀放置-80℃保存。
3.根据权利要求1所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(2)中所述目的基因的扩增具体为：根据新型氯霉素抗性基因的核酸序列，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物对；分别以环境样品基因组DNA和ddH2O为模板进行目的基因PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后使用胶回收试剂盒将目的基因片段纯化回收和测序。
4.根据权利要求3所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(3)中所述标准质粒的构建具体为：将步骤(2)中纯化后的目的基因片段与载体连接，转化至感受态细胞中，挑选单克隆使用通用引物对M13F/M13R进行菌落PCR验证阳性克隆。
5.根据权利要求4所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(4)中所述Q-PCR标准曲线的构建具体为：将步骤(3)中阳性克隆的PCR产物进行胶回收纯化，测定回收产物中DNA浓度，计算回收产物中DNA的拷贝数；随后对回收产物中DNA进行10倍梯度稀释，分别将稀释产物作为模板进行Q-PCR，构建相应的标准曲线。
6.根据权利要求5所述的高灵敏快速定量检测环境样品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步骤(5)中所述环境样品中新型氯霉素抗性基因的定量检测具体为：将环境样品的基因组DNA作为模板进行Q-PCR，其与步骤(4)中Q-PCR技术的体系和程序相同；根据步骤(4)中构建的Q-PCR标准曲线，对环境样品中新型氯霉素抗性基因的拷贝数进行定量。
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