[发明专利]一种用于羊肚菌菌丝的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种用于羊肚菌菌丝的定量检测方法，涉及免疫学定量检测技术及样品预处理技术领域，该方法包括标准品及待测样品预处理：取羊肚菌标准品或羊肚菌待测菌丝样品，清理后，冻干得到羊肚菌标准品冻干菌丝或羊肚菌待测菌丝样品冻干菌丝；标准品及待测样品制备：所得羊肚菌标准品冻干菌丝及羊肚菌待测菌丝样品冻干菌丝分别使用外切β‑葡聚糖酶进行酶解反应后，利用酶解反应产物分别配制成标准样品液及待测样品液；利用所得标准样品液及待测样品液进行ELISA双抗夹心检测，定量检测羊肚菌菌丝；该方法避免了影响羊肚菌质量与ELISA双抗夹心法最终所得OD值之间线性关系的影响因素，能够通过标准曲线准确计算样品中羊肚菌菌丝含量。

技术领域

本发明涉及免疫学定量检测技术及样品预处理技术领域，具体涉及一种用于羊肚菌菌丝的定量检测方法。

背景技术

羊肚菌又称羊肚菜，属于子囊菌亚门盘菌纲、盘菌目、羊肚菌科、羊肚菌属，是世界上珍贵的稀有食用菌之一；它是世界公认的著名珍稀食药兼用菌，其香味独特，营养丰富，功能齐全，食效显著。羊肚菌富含多种人体需要的氨基酸和有机锗，具补肾、壮阳、补脑，提神等功效。羊肚菌抗癌作用明显，对肌瘤细胞有强烈抑制作用，具有较高的食用价值和医用价值，在美国被称为“陆地鱼”，一直被欧美等发达国家作为人体营养的高级补品。羊肚菌在我国主要分布在云南、四川、甘肃、新疆、陕西、辽宁等地，安徽、河南境内也发现有羊肚菌。由于羊肚菌丰富的营养成分和重要的药用价值，人们称它为“天然、营养、多功能”的健康食品。目前已有多种羊肚菌实现了人工栽培。在羊肚菌的人工栽培中，早期和中期的菌丝定量检测是技术难点，目前最准确的检测方法仍然是PCR定量，在实验室条件下提取羊肚菌的DNA，通过PCR来定量检测，该方法检测精准，但通常对实验环境和设备要求较高，且检测周期长，费用相当昂贵。因此人们又开发了双抗夹心免疫酶联法检测羊肚菌菌丝，但该方法的前处理极其粗糙，引入大量干扰免疫检测的杂质，经检验，由于未知原因，通过该方法定量检测羊肚菌菌丝，并不能得到能够准确预测样品中羊肚菌菌丝含量的标准曲线，免疫酶联检测结果与实际含量之间并非线性关系，当羊肚菌含量在一定范围内时，这种非线性关系造成的检测误差较小，但当羊肚菌含量高于或低于某些数值时，这种误差可高达30％，这是定量检测不能允许的误差。

发明内容

为解决上述前处理不当导致的免疫监测误差问题，本发明提供一种新的用于羊肚菌菌丝的定量检测方法，方案如下：

一种用于羊肚菌菌丝的定量检测方法，包括以下步骤：

S1、标准品及待测样品预处理：取羊肚菌标准品或羊肚菌待测菌丝样品，清理后，冻干得到羊肚菌标准品冻干菌丝或羊肚菌待测菌丝样品冻干菌丝；

S2、标准品及待测样品制备：所得羊肚菌标准品冻干菌丝及羊肚菌待测菌丝样品冻干菌丝分别使用外切β-葡聚糖酶进行酶解反应后，利用酶解反应产物分别配制成标准样品液及待测样品液；

S3、利用所得标准样品液及待测样品液进行ELISA双抗夹心检测，定量检测羊肚菌菌丝。

优选地，S1所述清理，包括：取羊肚菌标准品或羊肚菌待测菌丝样品，加入无菌水，进行第一次震荡水洗；过滤后取菌丝，加入甲醇/乙醇混合溶液震荡醇洗；离心后取沉淀，再加入无菌水，进行第二次震荡水洗，离心后取沉淀。

优选地，S1所述清理还包括确定震荡醇洗时间的步骤：

S11，确定震荡醇洗时间的初选范围(a，b)；a取值2-5min，b取值7-10；

S12，取经过第一次煎煮过滤后的滤渣10个样品，分别按煎煮时间a和a+(b-a)/n，进行煎煮，过滤后得到醇洗液，n取值5-15；测定醇洗液中的干扰物A的含量，分别记为向量X1和X2；

S13，通过下式计算X1和X2的均一度：