[发明专利]一种合成核酸的方法

权利要求书

1.一种合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、合成寡核苷酸引物：在寡核苷酸引物FP和寡核苷酸引物BP包含有茎环结构和单链末端结构的核苷酸片段形成寡核苷酸引物；

S2、合成核酸：靶标核酸在步骤S1的寡核苷酸引物和Bst聚合酶下进行聚合反应；

所述步骤S1中寡核苷酸引物FP至少含有M区、1区和2区，所述2区和M区的5’侧相连，所述1区和2区的5’侧相连，所述M区是含有与靶标核酸MC区互补的核苷酸序列，所述2区是含有茎环结构的核苷酸序列，所述1区是含有单链末端结构的核苷酸序列；所述寡核苷酸引物BP至少含有N区、3区和4区，所述3区和N区的5’侧相连，所述4区和3区的5’侧相连，所述N区是含有与靶标核酸相同的N区核苷酸序列，所述3区是含有茎环结构的核苷酸序列，所述4区是含有单链末端结构的核苷酸序列；

所述寡核苷酸引物的Tm值≥反应温度。

2.如权利要求1所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中核酸合成的具体步骤包括四部分：

第一部分：

1）、靶标核酸在反应温度下动态解离，寡核苷酸引物FP的M区与靶标核酸的MC区退火，在Bst聚合酶作用下延伸，得到第一合成核酸；所述第一合成核酸的3’端含有靶标核酸的NC区，5’端含有1区、2区和M区；

2）、第一合成核酸与靶标核酸在反应温度下动态解离，寡核苷酸引物BP的N区与第一合成核酸的NC区退火，在Bst聚合酶作用下延伸，得到第二合成核酸；所述第二合成核酸含有靶标核酸的MC区和N区，所述第二合成核酸的3’端含有1C区和2C区，5’端含有3区和4区；

3）、所述第二合成核酸与靶标核酸在反应温度下动态解离，通过分子内杂交形成3’端和5’端含有茎环结构和单链末端结构形式；

4）、寡核苷酸引物FP与第二合成核酸的1C、2C和MC区通过碱基互补配对，在Bst聚合酶作用下延伸，形成双链结构，一条含4区、3区、N区和MC区、2C区、1C区；一条含1区、2区、M区和NC区、3C区、4C区；

5）、步骤4）形成的双链结构在反应温度下动态解离，通过分子内杂交形成3’端和5’端含有茎环结构和单链末端结构形式；

6）、步骤3）到步骤5）循环聚合反应，合成核酸产物；

和；第二部分：

1）、靶标核酸在反应温度下动态解离，寡核苷酸引物BP的N区与靶标核酸的NC区退火，在Bst聚合酶作用下延伸，得到第一合成核酸；所述第一合成核酸的3’端含有靶标核酸MC区，5’端含有4区、3区和N区；

2）、第一合成核酸与靶标核酸在反应温度下发生动态解离，寡核苷酸引物FP的M区与第一合成核酸的MC区退火，在Bst聚合酶作用下延伸，得到第二合成核酸；所述第二合成核酸含有靶标核酸M区和NC区，所述第二合成核酸的5’端含有1区和2区，3’端含有3C区和4C区；

3）、所述第二合成核酸与靶标核酸在反应温度下动态解离，通过分子内杂交形成3’端和5’端含有茎环结构和单链末端结构形式；

4）、寡核苷酸引物BP与第二合成核酸的4C、3C和NC区通过碱基互补配对，在Bst聚合酶作用下延伸，形成双链结构，一条含1区、2区、M区和NC区、3C区、4C区；一条含4区、3区、N区和MC区、2C区、1C区；

5）、步骤4）形成的双链结构在反应温度下动态解离，通过分子内杂交形成3’端和5’端含有茎环结构和单链末端结构形式；

6）、步骤3）到步骤5）循环聚合反应，合成核酸产物；

和；第三部分：

第一部分的步骤5）中，形成的两端含有茎环结构和单链末端结构形式进入第二部分反应过程，通过第二部分的步骤3）到步骤5）循环聚合反应，合成核酸产物；

和；第四部分：

第二部分的步骤5）中，形成的两端含有茎环结构和单链末端结构形式进入第一部分反应过程，通过第一部分的步骤3）到步骤5）循环聚合反应，合成核酸产物。

3.如权利要求2所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述反应温度为60℃～67℃。

4.如权利要求1或2所述的合成核酸的方法，其特征在于，所述靶标核酸为双链核酸或单链核酸。