[发明专利]一种人卵母细胞体外成熟液及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，公开了一种人卵母细胞体外成熟液及其制备方法，成熟液配方包括：以无机盐溶液为基础液，添加褪黑素5‑15μM/L和亚硒酸盐3‑10mg/L；所述无机盐溶液包括无机盐、能量物质，氨基酸，维生素，激素和生长因子。本发明以生理盐溶液为基础液，添加褪黑素和亚硒酸盐，并以重组的激素和蛋白替代动物源或人源性相关成分，方便促进人卵母细胞体外成熟。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人卵母细胞体外成熟液及其制备方法和应用。

背景技术

卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)是指在卵泡未成熟时提前将卵母细胞取出并在体外成熟，避免卵巢过度刺激的风险。人类首例IVM的妊娠诞生于1991年，首例用自身未成熟卵经体外成熟而获得的妊娠报道于1994 年。至今，有超过2500个IVM技术的新生儿诞生。IVM主要适用于有卵巢刺激过度综合症风险(如多囊卵巢综合症，PCOS)或某些不适宜进行超促排卵的病人。

有研究表明，人类卵泡内含有高浓度的褪黑素。IVM来源的卵母细胞质量较差与其卵泡内褪黑素浓度相关，在PCOS患者卵泡内的褪黑色明显低于其它接受IVF治疗的女性，这可能是PCOS患者无排卵和卵母细胞质量差的原因。褪黑素与其受体的结合通过丝裂原活化蛋白激酶途径和Elk-1的活化直接调控人颗粒-叶黄素细胞中孕酮的产生、LH受体基因表达和促性腺激素释放激素受体基因表达，从而影响卵泡及卵母细胞的成熟。

在体外成熟的培养过程中，因高氧化应激导致的脂质过氧化增加会对卵母细胞造成不利影响。硒(Se)是人体必需的微量元素，对生殖、免疫、抗氧化系统、胚胎生长等生理功能具有重要作用。有研究表明硒可通过调节谷胱甘肽过氧化物酶的活性来防止过氧化物对胚胎的损伤。

激素，生长因子及蛋白是卵母细胞体外成熟培养的重要成分，而这些成分多来源于动物源或人源性原料，从而存在微生物感染的风险。

因此，如何提供一种人卵母细胞体外成熟液及其制备方法，以促进人卵母细胞体外成熟成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于如何提供一种人卵母细胞体外成熟液及其制备方法，以促进人卵母细胞体外成熟。

为此，根据第一方面，本发明实施例公开了一种人卵母细胞体外成熟液，配方包括：以无机盐溶液为基础液，添加褪黑素5-15μM/L和亚硒酸盐3- 10mg/L；所述无机盐溶液包括无机盐、能量物质，氨基酸，维生素，激素和生长因子。

本发明进一步设置为，所述无机盐包含氯化钠90.5～110.5mM/L、氯化钾 3.52～5.90mM/L、二水氯化钙0.89～2.10mM/L、磷酸二氢钾0.05～1.5mM/L、七水硫酸镁0.18～2.20mM/L、碳酸氢钠20～28mM/L、抑菌成份硫酸庆大霉素 0.01～0.05g/L和人血白蛋白5～10g/L。

本发明进一步设置为，所述能量物质包括丙酮酸钠0.05～0.10mM/L、L-乳酸钠2.50～22.00mM/L和葡萄糖0.50～5.55mM/L。

本发明进一步设置为，所述氨基酸包括必需氨基酸1～2％(v/v)和非必需氨基酸0.45～1％(v/v)。

本发明进一步设置为，所述维生素含量0.45～1％(v/v)。

本发明进一步设置为，所述激素和生长因子包括重组胰岛素样生长因子 (rIGF-1)0.01～1mg/mL，重组表皮细胞生长因子(rEGF)0.01～1mg/mL，重组促卵泡激素(rFSH)0.05～10IU/mL以及重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG) 0.05～10IU/mL。

本发明进一步设置为，还包括酚红0.01g/L。

根据第二方面，本发明实施例公开了一种制备上述第一方面所述的人卵母细胞体外成熟液的方法，其特征在于，包括以下步骤：