[发明专利]一种敲除FUT8基因的方法及其获得的抗体

说明书

本发明公开一种敲除FUT8基因以提高抗体ADCC活性的方法。利用CRISPR/Cas9技术编码CHO细胞的FUT8基因，得到FUT8基因沉默的CHO细胞。通过对工程化细胞表达抗体的理化性质及生物活性检测，糖型检测结果表明工程化细胞表达的抗体的岩藻糖完全消除，以IMAB362抗体为对照，工程化细胞表达的完全无岩藻糖抗体与Claudin18.2‑CHO的亲和力相当，ADCC效应提高数倍。

技术领域

本发明涉及生物领域，特别提供了一种敲除FUT8基因以提高抗体ADCC活性的方法，以及使用该方法获得的抗体、组合物及其用途。

背景技术

ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)是指由NK(natural killer)细胞引发的一系列免疫反应，NK细胞通过FcγRIII受体与抗体分子恒定区(Fc)结合，然后通过穿孔素和颗粒酶在靶细胞表面引起细胞降解和引发细胞凋亡。已有研究表明在IgG抗体的Fc片段CH2结构域Asn297部位的糖链结构去除岩藻糖时，可以增强NK细胞的FcγRIIIa与IgG抗体的Fc片段之间的结合力，从而增强抗体的ADCC效应。然而，抗体分子的恒定区和FcγRIII受体之间的相互作用对抗体分子恒定区的糖基化水平非常地敏感，完全没有糖基化的抗体恒定区或者糖基化程度过高的抗体恒定区都无法正常地与FcγRIII受体正常结合。根据报道发现，岩藻糖基化的水平没有岩藻糖基化的Fc端与FcγRIII受体的亲和力明显要比岩藻糖基化的Fc端高，相应的ADCC体外作用活性要强上百倍。

多数由哺乳动物细胞产生的单克隆抗体是岩藻糖基化的，岩藻糖与抗体Fc端上的氨基葡萄糖通过一个α-1,6糖苷键结合。在哺乳动物细胞中，糖苷键由FUT8基因编码的α-1,6-岩藻糖基转移酶催化形成。敲除FUT8基因将完全消除抗体Fc端的岩藻糖，从而提高单抗药物的ADCC作用。这对于抗体药物发挥功能效应是十分重要的。

传统的基于同源重组的基因编辑技术是一个高投入、低产出并且费时费力的过程，往往需要从百万到百亿个细胞中才能筛选出一个被正确敲除的细胞。后续出现的一些可编码人工核酸酶基因编辑技术(如锌指酶、TALEN)，它们依靠其DNA结合结构域结合到基因组中特定的位点上，然后，依靠融合表达的酶切结构域，将该位点的DNA链切断。这样的人工核酸酶技术往往有着可识别序列受限制，编码过程复杂耗时以及作用效率低等缺点。

CHO细胞是目前单克隆抗体常用细胞株，生产抗体95％为岩藻糖基化。岩藻糖通过一个a-1,6糖苷键与抗体Fc端上的氨基葡萄糖结合。在哺乳动物细胞中，这个糖苷键由FUT8基因编码的a-1,6-岩藻糖基转移酶催化形成。通过对抗体表达细胞进行基因工程改造，敲除FUT8基因将完全消除抗体Fc端的岩藻糖，从而提高单抗药物的ADCC作用。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)即成簇出现规律间隔的短回文序列的缩写，此序列和CRISPR相关基因(Cas基因)共同作用，因其特有的RNA介导的核酸内切酶活性引起了生物学界的广泛关注，其中以来源于Streptococcus Pyogenes为代表的II类CRISPR/Cas9系统应用最为广泛，以RNA作为基因组定位工具，用特定序列的sgRNA(small-guide RNA)引导Cas9核酸内切酶识别并切割靶向序列。与ZFNs/TALENs相比，CRISPR/Cas9更易于操作，只需要设计跟靶序列配对的sgRNA即可，设计原则是在靶序列后紧跟一个PAM位点。CRISPR/Cas9的效率更高，可以在不同的位点同时引入多个突变。

CHO细胞是在工业上真核表达系统中运用最多的来表达抗体的宿主细胞。在本发明中，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对CHO细胞的FUT8基因进行编辑，使细胞中的a-1,6岩藻糖转移酶的功能丧失，产生完全去岩藻糖基化的抗体。