[发明专利]一种外泌体的保存方法

说明书

本发明公开了一种外泌体的保存方法，使用四氢嘧啶与外泌体混合，得到混合液进行保存。混合液中的四氢嘧啶的质量分数为0.5～5％，优选为3％。本发明使用四氢嘧啶在较低温条件下长期保存外泌体，可以保持外泌体的稳定性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种外泌体的保存方法。

背景技术

外泌体(Exosomes)是细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)的一种，大小在30～150nm，由细胞内的多泡小体(Multivesicularbodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动。同时，外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用。此外，外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。

外泌体具有双层脂膜的囊泡结构，其稳定性较好，可保护内部生物分子免受体液中各种酶的影响，从而保持其完整性和生物活性。但提取后的外泌体的完整性和生物活性可能受到保存介质、保存温度和时间等因素的影响。外泌体被提取后一般悬浮于磷酸盐(PBS)缓冲液。目前，最常用的储存方法为冷冻保存，但是冷冻保存可能会导致外泌体形状与物理性质的改变，也可能导致多层囊泡的形成和聚集，反复冻融会导致外泌体表面分子的生物特性、含量和标志物组成发生变化。虽然-80℃被公认是各种生物标本，如精液、尿、牛奶、血液和支气管肺泡灌洗液的最适宜的保存温度，但是冻融过程容易造成囊泡破坏，使外泌体中含有大量“污染物”，而且在处理或运输过程中有时很难维持这种低温条件。4℃保存虽然能够使囊泡保持良好的完整性，但是容易导致外泌体中蛋白和核酸的损失。因此，如何有效保存外泌体，一直以来都是外泌体研究领域的一个难题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提出一种外泌体的保存方法，使用四氢嘧啶在较低温条件下长期保存外泌体，可以保持外泌体的稳定性。

为此，本发明采用以下技术方案：

一种外泌体的保存方法，使用四氢嘧啶与外泌体混合，得到混合液进行保存。

优选的，所述四氢嘧啶使用前预冷30min以上。

优选的，所述混合液中的外泌体的粒子浓度为106～1012/mL。

优选的，所述混合液中的所述四氢嘧啶的质量分数为0.5～5％。

优选的，所述混合液中的所述四氢嘧啶的质量分数为3％。

优选的，所述混合液的保存温度为-80～4℃。

优选的，所述混合液的保存温度为4℃，周期为2周。

优选的，所述混合液的保存温度为-20℃，周期为2个月。

本技术方案的有益之处在于：使用四氢嘧啶作为保护剂，成分简单，新鲜的外泌体使用四氢嘧啶保护剂在较低温条件下进行保存，可以提高保存效果，保持外泌体的稳定性，避免外泌体在粒径、浓度和活性上的变化。

附图说明

图1为实验例1、3、4和对照例的外泌体粒径分布图；

图2为实验例1、3、4和对照例的外泌体的增殖能力图；

图3为实验例3在4℃条件下保存不同的时间后的外泌体粒径分布图；

图4为实验例3在-20℃条件下保存不同的时间后的外泌体粒径分布图；

图5为对照例在-80℃条件下保存不同的时间后的外泌体粒径分布图；

图6为在4℃条件下保存2周的实验例3的外泌体的透射电镜检测图；