[发明专利]一种重组酯酶突变体、基因、工程菌及拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的应用

说明书

本发明公开了一种重组酯酶突变体、基因、工程菌及拆分(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯的应用，所述重组酯酶突变体氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明对野生型的酯酶BaCE进行了定点突变，得到了立体选择性提高的突变体。该突变体重组质粒转化至大肠杆菌中，构建成大肠杆菌工程菌；该工程菌经超声破碎，过柱纯化得到重组酯酶突变体；利用大肠杆菌工程菌或重组酯酶突变体为生物催化剂拆分(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯，得到产物(S)‑吲哚啉‑2‑甲酸，其转化率达49％，产物的光学纯度达到98％以上。

(一)技术领域

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地说，涉及利用基因突变技术制备一种立体选择性酯酶突变体及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。

(二)背景技术

培哚普利是血管紧张素(angiotensin)转化酶(ACE)抑制剂培哚普利拉的前药酯，除了降低血压的作用外，该药物还能改善内皮功能以及使血管和心脏结构与功能正常化。目前(S)-吲哚啉-2-羧酸的合成主要以化学法为主。但是化学法使用的手性助剂昂贵且难以回收利用，且反应步骤繁琐，需要高压环境，限制其商业化应用。酶法拆分凭借其反应条件温和、高立体选择性和环境友好的特性，越来越受到青睐。

目前，(S)-吲哚啉-2-羧酸及其甲酯的化学合成主要有四种方法，分别为手性助剂重结晶法、手性助剂不对称氢化法、手性助剂不对称还原法以及手性源合成法。手性助剂重结晶法：重结晶法的原理是使用光学活性化合物作为助剂，将特定的光学异构体选择性地沉淀为盐，与其他光学异构体分离得到纯产品。Vincent M等人将(+)-α-甲基苄基胺作为手性助剂，分离得到光学纯度为96％的(S)-吲哚啉-2-羧酸。而(+)-α-甲基苄基胺价格昂贵，不可回收利用，因此重结晶法难以工业化生产(S)-吲哚啉-2-羧酸。

手性助剂不对称氢化法：该方法是将底物和具有手性配体的金属催化剂加入溶剂中，然后对底物进行光学选择性氢化。Kuwano等人以吲哚啉-2-羧酸甲酯为底物，Rh(NBD)2SbF6作为催化剂，(R,R)-2,2-双(二苯基膦基)-1,1-双二茂铁作为配体，在含有碳酸铯的异丙醇溶液中(60℃和5.0Mpa)，制备具有光学纯度为95％的(S)-吲哚啉-2-羧酸。该方法使用昂贵的手性助剂进行氢化，且手性助剂难以合成。此外，由于上述氢化方法需要昂贵的设备和设施，因此不能用于大规模的生产。

手性源合成法：以单一构型的苯丙氨酸为手性源，采用硝基胺化法合成得到(S)-吲哚啉-2-羧酸。Liu等人以L-苯丙氨酸为初始原料，在硝酸脲/硫酸以及碳酸钾的作用下，硝基胺化生成(S)-6-硝基-吲哚啉-2-羧酸，然后利用盐酸和催化剂Pd/C脱去硝基制备(S)-吲哚啉-2-羧酸，其收率为42％，光学纯度为99.5％。该方法需要使用昂贵的原材料，且收率较低，反应能耗大。

目前，通过酶法拆分获得目的产物已经越来越受欢迎，经过基因工程改造的酶能显著提高对底物的拆分效果。另外，酶法拆分具有反应步骤简单、能耗低、副产物少、无污染等优点。因而，用改造后的工程酶来拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯有望取代化学法实现工业化应用。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高立体选择性重组酯酶突变体、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在生物法拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的应用，解决了用野生型重组酯酶制备(S)-吲哚啉-2-甲酸过程中ee.值偏低的技术难题。该重组酯酶突变体在转化率达到49％时(理论转化率50％)，(S)-吲哚啉-2-甲酸的e.e._p仍保持在98％以上，(S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的e.e._s也达到了97.90％。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种立体选择性重组酯酶突变体，所述重组酯酶突变体氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。