[发明专利]一种CSN1S1基因敲除载体及CSN1S1基因敲除乳腺上皮细胞的制备方法

说明书

本发明提供了一种CSN1S1基因敲除载体以及CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞的制备方法，涉及基因工程技术领域，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体质粒上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过该基因敲除载体简便、快速、高效地敲除了奶山羊CSN1S1基因，获得了纯合的敲除CSN1S1基因的奶山羊乳腺上皮细胞。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种CSN1S1基因敲除载体及CSN1S1基因敲除乳腺上皮细胞的制备方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统最早可追溯至1987年，科学家发现在大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近存在重复序列，用于对抗病毒的入侵和外源DNA。根据Cas蛋白的不同分为三种主要类型，分别为I型、II型和III型，而CRISPR/Cas9是基于II型CRISPR系统开发而来的，主要由RNA导向的Cas9核酸内切酶、一条导向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)组成。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，引导Cas9蛋白至靶序列上，Cas9蛋白的两个功能域可以发挥内切酶的切割作用，即HNH和RuvC结构域，分别切割基因组上与crRNA的互补链和非互补链，造成DNA的双链断裂(doublestrandbreak,DSB)，从而启动细胞内的DNA损伤修复机制，导致修复后发生插入/缺失(indel)，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的，目前该技术已经成熟的运用于原核及真核生物的基因组编辑中。

乳中的蛋白质主要由酪蛋白组成，如羊乳中的酪蛋白含量则达到了总蛋白质的90％以上，酪蛋白包含αs1-酪蛋白(Csn1s1)，β-酪蛋白(Csn2)，αs2-酪蛋白(Csn1s2)以及κ酪蛋白(Csn3)。αs1-酪蛋白是一类单链多肽，包含199个氨基酸残基，在山羊乳中的含量为5.6％，而在母乳中却不含有的αs1-酪蛋白。αs1-酪蛋白是一种容易引起人类过敏的蛋白，易诱发婴幼儿湿疹、腹痛、腹泻等过敏反应，更易危及婴幼儿的生命。编码酪蛋白的基因普遍具有多态性，CSN1S1基因的多态性不仅会影响羊乳中酪蛋白的含量，还会影响羊乳的营养特性和工艺特性，同时有研究表明CSN1S1基因中11bp的indel突变与关中奶山羊乳中的酸度有显著影响。

目前，对CSN1S1基因的研究主要集中在与泌乳及乳成分相关性状的研究上，有效的构建一种CSN1S1基因敲除乳腺上皮细胞系对于探究CSN1S1调节奶山羊乳蛋白代谢的分子机制和构建精准而快速的改善奶山羊乳品质的方法至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CSN1S1基因敲除载体，所述基因敲除载体能高效、快速、简便地敲除CSN1S1基因。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种CSN1S1基因敲除载体，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体质粒上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述CRISPR/Cas9载体骨架为PX458。

优选地，所述的DNA片段为特异性靶向奶山羊CSN1S1基因的sgRNA。

本发明还提供了一种上述基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据奶山羊CSN1S1基因第一个外显子序列设计打靶位点，所述第一个外显子序列如SEQ ID NO:1所示，所述打靶位点的靶序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)根据SEQ ID NO:2所示核苷酸序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

(3)将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应形成双链DNA；